張嬋娟　成　羿★　董學(xué)亮

·基礎(chǔ)研究·

輕揉推拿法對(duì)兔骨骼肌急性鈍挫傷組織觀察及IGFmRNA表達(dá)的影響

張嬋娟成羿★董學(xué)亮

目的 探討輕揉推拿法對(duì)骨骼肌鈍挫傷修復(fù)的作用及其可能機(jī)制。方法 將27只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為創(chuàng)傷推拿組（觀察組）和創(chuàng)傷對(duì)照組（對(duì)照組），每組各12只，另3只為正常組。采用“重物自由落體撞擊法”制作實(shí)驗(yàn)兔骨骼肌急性鈍挫傷模型。分別在3d、6d、10d、13d處死實(shí)驗(yàn)兔，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只實(shí)驗(yàn)兔，每只實(shí)驗(yàn)兔在兩條后腿致傷腓腸肌部位取標(biāo)本，共計(jì)6個(gè)標(biāo)本，采用光鏡組織學(xué)觀察評(píng)分、電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察和應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)對(duì)內(nèi)源性胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）mRNA的測(cè)定，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果 光鏡組織學(xué)觀察評(píng)分：創(chuàng)傷推拿組傷后第6、10、13天與創(chuàng)傷對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果創(chuàng)傷推拿組和創(chuàng)傷對(duì)照組在3d未見到肌衛(wèi)星細(xì)胞，6d可見激活的肌衛(wèi)星細(xì)胞，在10d和13d創(chuàng)傷推拿組肌組織趨于正常，創(chuàng)傷對(duì)照組有瘢痕形成；RT-PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源性胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）mRNA的表達(dá)量：各個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)與創(chuàng)傷對(duì)照組比較，創(chuàng)傷推拿組內(nèi)源性的IGF-1和IGF-2的mRNA含量在3、6d與創(chuàng)傷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。觀察組第10天開始，比創(chuàng)傷組高（P＜0.05）。結(jié)論 輕揉推拿法在中晚期可有效的改善兔骨骼肌鈍挫傷后的組織學(xué)愈合過程和愈合質(zhì)量。輕揉推拿法能促進(jìn)骨骼肌鈍挫傷后衛(wèi)星細(xì)胞的激活，進(jìn)一步促進(jìn)新肌生成。輕揉推拿法在中晚期對(duì)內(nèi)源性IGF-Ⅰ，IGF- Ⅱ的mRNA表達(dá)量上調(diào)有促進(jìn)作用，從而可加強(qiáng)成肌細(xì)胞增殖。

輕揉推拿法 骨骼肌損傷 組織學(xué) 電鏡 胰島素樣生長(zhǎng)因子 肌衛(wèi)星細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)自2009年10月至12月模仿臨床輕柔推拿手法對(duì)實(shí)驗(yàn)兔腓腸肌鈍挫傷的治療。通過光鏡觀察組織學(xué)變化，電鏡下觀察肌肉組織的超微結(jié)構(gòu)，以及應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)內(nèi)源性胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）mRNA的測(cè)定，以了解輕柔推拿手法對(duì)骨骼肌損傷修復(fù)的進(jìn)程和質(zhì)量。探討輕柔推拿手法對(duì)骨骼肌修復(fù)的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中國(guó)大白兔27只，雌13只、雄14只，平均體重（2.5±0.2）kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)及取標(biāo)本皆在該中心完成。

1.2主要試劑 Trizol試劑（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。2×Taq MasterMix（含染料）酶（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。100bp DNA Ladder Marker［TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司］。

1.3方法 （1）動(dòng)物造模：參照張靜［1］的模型，并稍加改進(jìn)。制作過程：將實(shí)驗(yàn)兔俯臥位固定于解剖臺(tái)，再褪去雙后肢腿毛，利用重力棒，選定腓腸肌肌腹中段作為撞擊中心，重物自由落體下落導(dǎo)致一次撞擊傷，造成腓腸肌急性挫傷模型。（2）分組處理：將27只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為創(chuàng)傷推拿組（觀察組）和創(chuàng)傷對(duì)照組（對(duì)照組），每組各12只，另3只為正常組。分別于3d、6d、10d、13d處死實(shí)驗(yàn)兔取標(biāo)本。觀察組：傷后第3天開始推拿，10～20min/d。推拿方法：在兔小腿三頭肌處采用化瘀止痛輕揉手法：先用輕推法，以大拇指指端著力于跟腱，向腘窩方向進(jìn)行直線推移。頻率20次/min，持續(xù)5min。再用拇指揉法，持續(xù)5 min，頻率為60～80次/min。最后用擦法，即用手掌的大魚際做跟腱與腘窩間的來(lái)回摩擦，頻率80～100次/min，持續(xù)5min。對(duì)照組僅予紗布包扎傷處。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組處死3只實(shí)驗(yàn)兔，每只實(shí)驗(yàn)兔兩條后腿挫傷處腓腸肌標(biāo)本，計(jì)24份。分別做RT-PCR檢測(cè)內(nèi)源性IGF的mRNA、做組織學(xué)分析、電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成 檢索 NCB I GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ全長(zhǎng)基因序列，應(yīng)用Pri mer p remier5.0軟件設(shè)計(jì)出IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ基因引物以及內(nèi)參GAPDH基因的上下游引物序列。引物均由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1光鏡組織學(xué)觀察結(jié)果 參照文獻(xiàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2］進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)分。對(duì)照組撞挫傷后3d，組織切片中均見表皮出血、壞死灶、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肌纖維透明樣變性，肌纖維間見水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。6d后，表皮及皮下仍有出血、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，皮下水腫，肌纖維透明變性，其中組織內(nèi)仍見出血灶、壞死、水腫、肌纖維透明變性。10d后，表皮及皮下仍有瘀血、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，皮下水腫，肌纖維透明變性，其中組織內(nèi)仍見壞死、水腫、肌纖維透明變性。13d后，表皮及皮下仍有壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，皮下水腫，肌纖維透明變性，其中組織內(nèi)仍見壞死、水腫、肌纖維透明變性。觀察組造模后：第3天，有皮下水腫、出血、壞死、肌纖維透明變性。第6天，有皮下水腫、瘀血、壞死、肌纖維透明變性；組織內(nèi)見纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)，瘀血、水腫減輕。第10天，組織內(nèi)見纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)，水腫減輕，組織中可見部分肌纖維腫脹，偶見組織內(nèi)有瘀血灶，膠原纖維增生。第13天，組織內(nèi)見纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)，水腫減輕，組織中可見到部分肌纖維腫脹，偶見組織內(nèi)有瘀血灶，并可見血管、膠原纖維增生。皮下水腫、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)已消失。見表1。

表1　鏡下組織學(xué)結(jié)果比較（x±s）

2.2電鏡觀察結(jié)果 成模3d對(duì)照組肌纖維紊亂、崩解局灶壞死，Z線模糊糖元沉積，低劑量組損傷處肌纖維排列紊亂，Z線模糊，局灶性肌纖維溶解。觀察組損傷處肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂、崩解、局灶壞死。傷后6d，對(duì)照組肌組織斷裂處Z線紊亂，肌衛(wèi)星細(xì)胞激活并向內(nèi)移，伴有肌纖維溶解。觀察組肌衛(wèi)星細(xì)胞激活，并向短處內(nèi)移，肌質(zhì)網(wǎng)增生擴(kuò)張，肌纖維再生。傷后10d對(duì)照組損傷處肌組織進(jìn)一步溶解萎縮，逐漸被纖維膠原瘢痕組織替代。觀察組損傷處有新生的肌纖維，并逐漸修復(fù)。傷后13d，對(duì)照組成纖維細(xì)胞，周圍有糖原顆粒和膠原纖維，瘢痕形成，觀察組損傷處局部紊亂肌纖維接近正常肌纖維。

2.3檢測(cè)RNA表達(dá)結(jié)果 見表2、3。

表2　同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)內(nèi)源性IGF-Ⅰ的mRNA含量比較（x±s）

表3　同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)源性IGF-Ⅱ的mRNA含量比較（x±s）

3　討論

四肢軟組織損傷處，施于揉法具有活血化瘀、通絡(luò)舒筋、消腫止痛的作用，從而使氣行則血行，血活則瘀去，瘀去則生新，損傷的組織即可得到修復(fù)［3］。骨骼肌損傷后恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，愈合質(zhì)量不可靠，易反復(fù)再傷，遷延數(shù)年，直至肌肉變性和瘢痕形成。而通過輕柔推拿法作用于受損部位的體表和穴位，則能導(dǎo)致局部經(jīng)絡(luò)反應(yīng)，激發(fā)和調(diào)整經(jīng)氣，疏通經(jīng)絡(luò)，同時(shí)增強(qiáng)氣血生化和運(yùn)行，起到祛瘀、消滯、生新的作用［4］，促進(jìn)骨骼肌損傷后愈合。

該實(shí)驗(yàn)是模仿臨床輕柔推拿手法對(duì)實(shí)驗(yàn)兔腓腸肌鈍挫傷進(jìn)行治療。實(shí)驗(yàn)首先采用組織學(xué)觀察的評(píng)分方法，作為治療效果的指標(biāo)，判斷治療效果準(zhǔn)確性較高。采用經(jīng)典的組織學(xué)評(píng)分方法，能較準(zhǔn)確的表達(dá)推拿在組織學(xué)觀察方面促進(jìn)骨骼肌修復(fù)的作用，即評(píng)分越低其修復(fù)作用越佳。由于推拿在第3天后開始，觀察組第3天與創(chuàng)傷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在第6、10、13天，觀察組有明顯差異（P＜0.05），表明推拿能有效的降低組織學(xué)評(píng)分，改善表皮出血、組織壞死灶、肌纖維透明樣變性，肌纖維間水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等骨骼肌損傷和修復(fù)的組織學(xué)表現(xiàn)。

根據(jù)電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組損傷后3d肌肉表現(xiàn)為肌纖維排列紊亂、崩解、局灶壞死，Z線模糊糖元沉積，觀察組可見損傷處肌纖維紊亂，Z線模糊，局灶性肌纖維溶解和對(duì)照組相似，這與推拿從第3天開始有關(guān)。傷后第6天對(duì)照組損傷處觀察到肌衛(wèi)星細(xì)胞，但是不如觀察組，觀察組衛(wèi)星細(xì)胞激活，并向損傷處內(nèi)移，肌質(zhì)網(wǎng)增生擴(kuò)張，肌纖維再生。傷后10d對(duì)照組損傷處逐漸被瘢痕組織替代，而觀察組肌衛(wèi)星細(xì)胞發(fā)育成新的成肌細(xì)胞，新的肌纖維替代損傷處。傷后13d時(shí)，對(duì)照組為瘢痕愈合，而觀察組基本恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)通過觀察損傷處骨骼肌的電鏡超微結(jié)構(gòu)表明：推拿能夠激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)骨骼肌損傷后愈合。

近年來(lái)開展的生長(zhǎng)因子（GF）促進(jìn)組織愈合研究［5～8］，在骨骼肌愈合方面已取得一些進(jìn)展。在尚未發(fā)現(xiàn)特異性骨骼肌生長(zhǎng)因子前，采用細(xì)胞培養(yǎng)加各種GF或損傷局部直接注射GF的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)胰島素樣生長(zhǎng)因子（ICF-Ⅰ和IGF-Ⅱ）可以加強(qiáng)成肌細(xì)胞增殖，增加成肌細(xì)胞分化形成肌管，同時(shí)增強(qiáng)再生肌肉的收縮力和強(qiáng)直力，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)內(nèi)源性IGF-I和IGF-Ⅱ的mRNA表達(dá)，可了解骨骼肌損傷后的愈合情況。

本資料顯示，正常實(shí)驗(yàn)兔腓腸肌內(nèi)源性IGFI的mRNA表達(dá)量較低，與對(duì)照組和觀察組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組隨著時(shí)間點(diǎn)的不同，IGF-I的mRNA表達(dá)量有波動(dòng)。第3天IGFI的mRNA表達(dá)量較正常組高，第6天達(dá)到峰值，第10天下降，第13天基本回到第3天水平，但是較正常組織高。觀察組與對(duì)照組比較，第3、6天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第10、13天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。推拿能夠上調(diào)兔急性鈍挫傷腓腸肌局部的內(nèi)源性IGF-I的mRNA表達(dá)量，因此推測(cè)通過上調(diào)局部?jī)?nèi)源性IGF-I mRNA是推拿促進(jìn)骨骼肌愈合的途徑之一，即推拿促進(jìn)急性鈍挫傷骨骼肌愈合的作用機(jī)制之一是使局部?jī)?nèi)源性IGF-I的mRNA表達(dá)上調(diào)，從而通過內(nèi)源性IGF-I mRNA實(shí)現(xiàn)修復(fù)急性鈍挫傷的骨骼肌組織。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)源性IGF-Ⅱ的mRNA表達(dá)，正常實(shí)驗(yàn)兔腓腸肌內(nèi)源性IGF-Ⅱ的mRNA表達(dá)量極低，基本檢測(cè)不到。對(duì)照組隨著時(shí)間點(diǎn)的不同，IGF-Ⅱ的mRNA表達(dá)量有波動(dòng)。第3天IGF-Ⅱ的mRNA表達(dá)量較正常組高，第6天達(dá)到峰值，第10天下降，第13天基本回到第3天水平，但是較正常組織高。觀察組與對(duì)照組比較，第3天、第6天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第10、13天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。推拿能夠上調(diào)實(shí)驗(yàn)兔急性鈍挫傷腓腸肌局部的內(nèi)源性IGF-Ⅱ的mRNA表達(dá)量，因此推測(cè)通過上調(diào)局部?jī)?nèi)源性IGF-Ⅱ mRNA是推拿促進(jìn)骨骼肌愈合的另一途徑和作用機(jī)制。

結(jié)合內(nèi)源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的mRNA檢測(cè)結(jié)果、光鏡組織學(xué)評(píng)分、電鏡觀察，觀察組在治療實(shí)驗(yàn)兔骨骼肌急性鈍挫傷中后期效果明顯。通過上調(diào)內(nèi)源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的mRNA表達(dá)量是推拿促進(jìn)急性骨骼肌鈍挫傷愈合的一種途徑和機(jī)制。

1 張靜，趙斌.按摩對(duì)兔骨骼肌挫傷后修復(fù)作用的研究.河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2003.5.

2 周國(guó)林，姚全勝，潘玉英.一種動(dòng)物軟組織損傷的實(shí)驗(yàn)方法.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1991， 7（5）：396～398.

3 周信文，推拿手法學(xué)，上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，1996.141.

4 劉仁建，唐成林，鄒敏，等.按摩對(duì)兔骨骼肌頓挫傷修復(fù)過程中IGF-I的影響.激光雜志，2013，34（4）：102～104.

5 魏俊輝.類胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白.國(guó)外醫(yī)學(xué)（內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)），1994，14（4）：175～177.

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Objective To study the function of massage in recovery from blunt skeletal muscular contusion and its possible mechanism. Method 27 rabbits were randomly divided into the massage group，the trauma comparison group，each with 12 rabbits，and the normal comparison group with the other 3 rabbits. The model of acute blunt skeletal muscular contusion is made by using the “blow of heavy weight free falling”. Three rabbits from each group were put to death at each time point on the 3rd day，the 6th day，the 10th day and the 13th day，with 2 hind gastrocnemius muscles from each rabbit taken as specimens，6 specimens in total each time. By the observation and rating based on light microscopic histology，the observation of ultrastructure through electron microscopy，and by using the reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）technology to determine the endogenous insulin-like growth factor （IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ）mRNA，each set of the data is collected for statistical analysis. Results Based on light microscopic histological rating，it was statistically rewarding to compare the massage group on the 6th day，the 10th day and the 13th day after injury with the trauma comparison group （P＜0.05）. Based on ultrastructural electron microscopic observations，no muscle satellite cells were seen on the 3rd day both in the massage group and the trauma group. On the 6th day，more activated muscle satellite cells were seen. On the 10th day and the 13th day，the muscle tissue of the massage group tended to be normal，while scars were formed in the trauma group. By using the RT-PCR technology to detect the mRNA expression levels of endogenous insulin-like growth factors （IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ），a comparison with the trauma group within various time points showed that the massage group had equally the same endogenous IGF-1 and IGF-2 mRNA levels on the 3rd and the 6th day，which has no statistical signifi cance； while from the 10th day onwards，the massage group started to show higher levels than the trauma group （P＜0.05）. Conclusions Firstly，the effects of gentle massage at the intermediate and late stages after the rabbit’s blunt skeletal muscle contusion can effectively improve the histological healing process and healing quality. Secondly，the effects of gentle massage can promote the activation of satellite cells after blunt skeletal muscle contusion，thus further promoting new muscle formation. Thirdly，the effects of gentle massage at the intermediate and late stages can help increase the endogenous IGF-I and IGF-Ⅱ mRNA expression levels，which leads to the reproduction of muscle cells.

The effects of gentle massage Muscle damage Histology Electron microscopy Insulin-like growth factor muscle satellite cells

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009C33100）

310007 杭州市中醫(yī)院