丁軍利　劉超英　許雋穎

自體CIK細(xì)胞治療對(duì)老年非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞EMT的影響

丁軍利劉超英許雋穎

目的 探討自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）細(xì)胞治療對(duì)老年非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。方法 應(yīng)用免疫磁珠分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)EMT標(biāo)記物CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail在CIK治療前后的表達(dá)變化，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，比較CIK治療前后患者卡氏行為狀態(tài)（KPS）評(píng)分的變化。結(jié)果 40例肺癌患者中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK19、E-cadherin的mRNA陽性表達(dá)率分別是90%（36/40）和17.5%（7/40），間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin、Snail的mRNA陽性表達(dá)率分別是60%（24/40）和62.5%（25/40）。CK19、Vimentin、Snail的陽性表達(dá)率與性別無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤的大小、病理分型、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05）。E-cadherin的陽性表達(dá)率極低，與臨床病理特征均無相關(guān)性。CIK治療后CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail的mRNA陽性表達(dá)率均顯著下降，分別為62.5%（25/40）、0%（0/40）、20%（8/40）、10%（4/40），而且CIK治療后患者KPS評(píng)分顯著提高（P＜0.05）。結(jié)論 老年肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞存在EMT，并與腫瘤進(jìn)展正相關(guān)，自體CIK細(xì)胞治療抑制了EMT，并提高了患者的生活質(zhì)量。

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 老年非小細(xì)胞肺癌 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%左右，30%患者可行手術(shù)治療，約70%～80%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期［1］。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells，CIK）具有溶瘤譜廣、溶瘤活性高等優(yōu)點(diǎn)，故CIK在腫瘤的生物治療領(lǐng)域中極具應(yīng)用價(jià)值［2］。本科自2014年4月至2015年6月開展自體CIK治療老年肺癌40例獲得良好效果，報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 觀察組：40例老年肺癌患者均經(jīng)病理檢查證實(shí)，男30例，女10例；年齡65～80歲，中位年齡70歲。其中腺癌30例、鱗癌10例。按TNM國(guó)際分期法：Ⅲ期10例、Ⅳ期30例。40例患者均有可測(cè)量腫瘤病灶；Karnofsky評(píng)分＞60分，預(yù)計(jì)生存期＞3個(gè)月；治療前患者心、肝、腎功能及血常規(guī)無明顯異常；采血前1個(gè)月及治療期間均未接受過放、化療。行CIK治療前簽署治療知情同意書。對(duì)照組：10例本院體檢健康人（志愿者），男6例，女4例，年齡60～75歲，中位年齡68歲。

1.2方法 （1）血樣處理：采集40例腫瘤患者和10例健康志愿者的外周血10ml，使用EDTA管室溫保存，于4h內(nèi)處理。將血樣與10倍體積的溶血素混合，冰上孵育15min，12000r/min離心5min，棄上清液，PBS洗滌2次，制成細(xì)胞懸液。（2）循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的免疫磁性標(biāo)記、富集和分選：將Fc受體阻斷劑（100μl）和單克隆EpCAM抗體偶聯(lián)的磁性微珠（100μl）先后加入樣本的細(xì)胞懸液中，混勻，4～8℃孵育30min，然后按操作說明將細(xì)胞懸液流經(jīng)置于磁場(chǎng)中的MS分選柱進(jìn)行EpCAM陽性細(xì)胞分選。由于分選出的EpCAM陽性細(xì)胞數(shù)量有限，為避免凍存后細(xì)胞損失，將分選后的EpCAM陽性細(xì)胞立刻進(jìn)行RNA的提取和檢測(cè)。（3）實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：采用RT-PCR法檢測(cè)通過MACS富集的CTCs相關(guān)基因表達(dá)。按說明書應(yīng)用Trizo1試劑盒（Invitrogen公司）提取樣本RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒均購于大連寶生物工程公司。所用的引物均由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成。反應(yīng)條件：95℃30s，95℃5s，55℃30s，72℃30s 40個(gè)循環(huán)。（4）CIK細(xì)胞的制備及回輸：血細(xì)胞分離機(jī)采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），經(jīng)淋巴分離液梯度離心（2000r/min，20min），取白膜層的單個(gè)核細(xì)胞，0.9%生理鹽水洗滌3次。將細(xì)胞置于IFN-γ1000U/ml無血清培養(yǎng)基，37℃、5% CO2中培養(yǎng)。24h后加入抗CD3單抗100ng/ml，人重組IL-2 1000U/ml，隔日換維持液培養(yǎng)8～10d，按4×109/次回輸患者體內(nèi)。培養(yǎng)和回輸過程參照衛(wèi)生部2003年3月頒布的“人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則”。（5）CIK治療前后臨床癥狀及毒副反應(yīng)觀察：主要觀察CIK細(xì)胞回輸過程中患者有無發(fā)熱、皮疹、惡心、嘔吐等不良毒副反應(yīng)，并且給予相應(yīng)的對(duì)癥處理；治療后14d觀察臨床癥狀改善情況，細(xì)胞治療前、治療后2周行卡氏行為狀態(tài)（KPS）評(píng)分。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EMT標(biāo)志物在CTC中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 在10例健康對(duì)照組樣本中未檢測(cè)出CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail的表達(dá)，在40例肺癌患者中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK19、E-cadherin的mRNA陽性表達(dá)率分別是90%（36/40）和17.5%（7/40），間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin、Snail的mRNA陽性表達(dá)率分別是60%（24/40）和62.5%（25/40）。CK19的陽性表達(dá)率與性別無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤的大小、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），而E-cadherin的陽性表達(dá)率極低，與臨床病理特征均無相關(guān)性。Vimentin、Snail的表達(dá)與性別無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤的大小、病理分型、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移均明顯相關(guān)（P＜0.05）。

2.2CIK治療對(duì)CTC的EMT的影響 40例肺癌患者，接受CIK治療后再次檢測(cè)CTC細(xì)胞中CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail 的mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果見表1。

表1　CIK治療前后CTC細(xì)胞中EMT標(biāo)志物表達(dá)變化（%）

2.3CIK治療對(duì)KPS評(píng)分的影響及毒副反應(yīng)的觀察 CIK治療前KPS評(píng)分80分15例、70分17例、60分8例。CIK治療后KPS評(píng)分80分20例、70分15例，60分5例?；颊咧委烱PS評(píng)分高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明患者生活質(zhì)量提高。3例患者回輸過程中出現(xiàn)低熱（＜38℃），多數(shù)患者均無明顯不適。

3　討論

肺癌屬于老年性疾病，＞50%晚期肺癌患者的發(fā)病年齡＞65歲，由于老年生理性功能退化與伴隨疾病的存在，使老年肺癌患者對(duì)化療的耐受性下降，不良反應(yīng)增加，老年非小細(xì)胞肺癌的治療倍受重視。CIK治療作為細(xì)胞免疫治療的一部分，具有高效低毒的特殊作用，為老年肺癌患者的治療提供了新的思路和方向。研究顯示CIK治療改善了肺癌患者的免疫功能，提高疾病控制率和生活質(zhì)量［3］，但具體機(jī)制不詳。

CTCs是腫瘤從原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)的惡性細(xì)胞。其形成是腫瘤的進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的首要因素［4］。研究顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）賦予了上皮型腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，參與了腫瘤異質(zhì)性的形成和轉(zhuǎn)移過程［5］。研究表明人類原發(fā)性腫瘤中存在EMT，循環(huán)腫瘤細(xì)胞中同樣存在EMT［6］?，F(xiàn)已確定的EMT標(biāo)志物包括E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist等。近年，CTCs在腫瘤進(jìn)展中的作用受到廣泛關(guān)注。研究顯示肺癌患者周圍血中存在CTC，對(duì)預(yù)測(cè)化療療效和預(yù)后判斷具有重要價(jià)值［7］。而CTC導(dǎo)致最終的轉(zhuǎn)移，EMT在其中發(fā)揮了重要作用。EMT使CTC間質(zhì)化，侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。然而，有關(guān)EMT、CTC和臨床病理特征之間的關(guān)系尚不明確，CIK治療是否通過抑制CTC發(fā)生EMT從而抑制腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移亦未明確。

本資料結(jié)果顯示10例健康對(duì)照組樣本中均未檢測(cè)出CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail的表達(dá)，而40例肺癌患者中，CTC上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK19、E-cadherin的mRNA陽性表達(dá)率分別是90%、17.5%，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin、Snail的mRNA陽性表達(dá)率分別是60%、62.5%，提示CTC存在EMT現(xiàn)象。CK19作為上皮組織來源的組織特異性標(biāo)記物，是文獻(xiàn)報(bào)道中檢測(cè)微轉(zhuǎn)移應(yīng)用最多的基因標(biāo)記［8］，結(jié)果顯示CK19的陽性表達(dá)率最高，提示其作為上皮標(biāo)記物靈敏度高。E-cadherin主要位于上皮細(xì)胞的緊密連接處，E-cadherin表達(dá)的減少和缺失可引起細(xì)胞間粘連的改變，細(xì)胞移動(dòng)性增加，導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［9］。檢測(cè)到E-cadherin mRNA的陽性表達(dá)率僅為17.5%，提示CTC在較大程度上失去了上皮細(xì)胞的特性。間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin、Snail的mRNA的陽性表達(dá)率較高，提示CTC獲得了間質(zhì)細(xì)胞的特性：侵襲和移動(dòng)性增強(qiáng)［10］。以上結(jié)果顯示CK19作為微轉(zhuǎn)移及CTC細(xì)胞特質(zhì)，具有靈敏性、特異性高特點(diǎn)，而E-cadherin、Vimentin、Snail對(duì)判斷CTC的轉(zhuǎn)化特征具有重要意義。

本資料結(jié)果亦顯示，CK19、Vimentin、Snail的mRNA陽性表達(dá)率與性別無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤的大小、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05）。而E-cadherin的陽性表達(dá)率偏低，與臨床病理特征均無相關(guān)性。CK19、Vimentin、Snail的陽性表達(dá)多出現(xiàn)在腫瘤＞3cm、腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移的肺癌患者。以上結(jié)果顯示聯(lián)合檢測(cè)CTC中CK19、Vimentin、Snail的mRNA表達(dá)可以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。

目前，CIK抑制腫瘤進(jìn)展的機(jī)制多集中在免疫功能研究［11］，是否影響CTC中EMT還未見報(bào)道。結(jié)果顯示CIK治療后CK19、E-cadherin、Vimentin、SnailmRNA陽性表達(dá)率分別為62.5%（25/40）、0%（0/40）、20%（8/40）、10%（4/40），均較CIK治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示CIK可能通過抑制CTC的EMT從而抑制腫瘤的進(jìn)展。另外，CIK治療后患者的KPS評(píng)分顯著提高，改善了老年晚期肺癌患者的生活質(zhì)量。

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Objective To investigate the effect of CIK on the epithelial- mesenchymal transition （EMT）of circulating tumor cells in elderly patients with non-small cell lung cancer. Methods Immunomagnetic separation technique has been applied toisolate CTCs. The EMT markers mRNA expression has been identifi ed by Real-time RT-PCR. The relationship between the expressions of EMT markers and clinicopathological features were analyzed. The KPS scores were also detected before and after CIK cell therapy. Result s The positivity rate of EMT markers is 90% （36/40，CK19），17.5% （7/40，E-cadherin），60 %（24/40，Vimentin），and 62.5% （24/40，Snail）respectively； There was signifi cant correlation between the expression of CK19，Vimentin and Snail mRNA expressions with the tumor size，lymph node metastasis，venous invasion，pathological type and clinical staging （P＜0.05）； CIK therapy signifi cantly decreased the mRNA positivity rate（CK19，62.5%； E-cadherin，0%； Vimentin，20%，Snail，10%），furthermore，CIK therapy improved the KPS scores of the patients （P＜0.05）. Conclusions EMT occurred in the CTC of elderly patients with non-small cell lung cancer and it may promote development of the disease； CIK therapies signifi cantly prevent the process of EMT.

CIK Elderly patients with non-small cell lung cancer Circulating tumor cells Epithelial-mesenchymal transition

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012099）

214023 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院腫瘤科