方　姍　孫建琦　葛加美

晚期糖基化代謝產(chǎn)物受體在子癇前期孕婦胎盤組織的表達(dá)及其意義

方姍孫建琦葛加美

目的 探討晚期糖基化代謝產(chǎn)物（RAGE）在子癇前期孕婦胎盤組織的表達(dá)及其作用。方法 選取2012年10月至2013年9月20例正常孕婦、20例輕度子癇前期孕婦及20例重度子癇前期孕婦。運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)三組中孕婦胎盤組織中RAGE蛋白表達(dá)水平，采用RTPCR法檢測(cè)胎盤組織內(nèi)RAGE mRNA表達(dá)水平。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 三組胎盤組織RAGE蛋白表達(dá)水平：對(duì)照組（0.418±0.0270）、輕度子癇組（0.732±0.038）、重度子癇組（1.045±0.041），子癇患者胎盤組織中RAGE蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），且重度子癇組表達(dá)水平顯著高于輕度子癇組（P＜0.01）。三組胎盤組織中RAGE mRNA水平分別為：對(duì)照組（0.276±0.031）、輕度子癇組（0.518±0.047）、重度子癇組（0.903±0.054）。子癇胎盤組織RAGE mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），且重度子癇組表達(dá)水平高于輕度子癇組（P＜0.01）。結(jié)論 胎盤組織中RAGE表達(dá)升高可能與子癇前期的發(fā)生及病情嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)。

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體 子癇前期 胎盤組織

子癇前期（PE）是妊娠期高血壓病的一種，是常見嚴(yán)重危害母嬰健康的并發(fā)癥之一［1］。近年來，隨著對(duì)子癇前期的進(jìn)一步了解，其治療方法及母嬰預(yù)后均明顯改善，但目前對(duì)其病因及發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。炎癥在子癇前期中的作用越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，晚期糖基化代謝產(chǎn)物（RAGE）屬于IG超家族，可通過多條信號(hào)通路參與炎癥過程。本資料通過檢測(cè)正常孕婦、輕度子癇前期孕婦、重度子癇前期孕婦胎盤組織中RAGE蛋白及其mRNA的表達(dá)水平，探討RAGE在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達(dá)情況及其意義。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2012年10月至2013年9月期間在嘉興市婦幼保健院產(chǎn)科住院患者作為觀察對(duì)象，輕度子癇前期孕婦20例，重度子癇前期孕婦20例，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照樂杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》［2］。對(duì)照組選取正常健康足月妊娠孕婦20例。所選取對(duì)象均為單胎妊娠，排除糖尿病、高血壓及免疫性疾病，無其他妊娠合并癥，分娩方式均選取剖宮產(chǎn)。觀察對(duì)象一般臨床資料比較見表1，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本項(xiàng)目通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本提供孕婦均知情并簽署同意書。

表1　各組一般臨床資料比較（±s）

表1　各組一般臨床資料比較（±s）

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1.2方法 （1）標(biāo)本的采集與處理：孕婦胎盤娩出后，立即于母體面中央處（避開出血及鈣化區(qū)）取1.0cm×1.0cm×1.0cm大小胎盤組織，生理鹽水沖洗3遍，干燥后裝入無菌EP管中，置于液氮中保存?zhèn)溆?。?）胎盤組織中RAGE蛋白的表達(dá)：采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。胎盤組織200mg剪碎，加入PIRA細(xì)胞裂解液，4℃，12000r/min離心30 min，收集上清液，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整各標(biāo)本濃度至相同，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離出蛋白帶，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，4℃封閉過夜，加入兔抗人的RAGE單克隆抗體（美國(guó)bioworld公司，稀釋比1：1000）室溫下免疫沉淀2 h，Tris 緩沖鹽溶液吐溫20（TBST）搖洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG（美國(guó)Earthox公司，稀釋比1：3000），室溫下放置2 h。TBST搖洗，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑均勻混合，充分浸膜，取膜，暗室中壓膠片，顯影。以GAPDH為對(duì)照，以RAGE與GAPDH灰度值比值表示RA GE的表達(dá)。（3）胎盤組織中RAGE mRNA的表達(dá)：采用RT-PCR法檢測(cè)。Trizol法提取100mg胎盤組織中的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物科技公司）說明進(jìn)行操作，引物由上?？禐槭兰o(jì)公司設(shè)計(jì)合成。擴(kuò)增條件為： 94℃ 5min，94℃30s，59℃ 30s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5μl于20g/L瓊脂糖凝膠中電泳。RAGE mRNA的表達(dá)以其與GAPDH的灰度值比值表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胎盤組織中RAGE蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組比較，輕度子癇前期組及重度子癇前期組RAGE蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01），且重度子癇組升高更顯著（P＜0.01），見圖1，表2。

表2　各組胎盤組織中RAGE蛋白表達(dá)水平比較［RAGE/GAPDH，（±s）］

表2　各組胎盤組織中RAGE蛋白表達(dá)水平比較［RAGE/GAPDH，（±s）］

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與輕度子癇比較，#P＜0.01

組別樣本數(shù)RAGE輕度子癇前期 200.732±0.038*重度子癇前期201.045±0.041*#對(duì)照組200.418±0.027 F值44.182 P值0.000

2.2胎盤組織中RAGE mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組比較，輕度子癇組和重度子癇組RAGE mRNA表達(dá)水平均顯著增高（P＜0.01），且重度子癇組升高較輕度子癇組更顯著（P＜0.01），見表3。

表3　各組胎盤組織中RAGE mRNA水平比較表達(dá)［RAGE/GAPDH，（±s）］

表3　各組胎盤組織中RAGE mRNA水平比較表達(dá)［RAGE/GAPDH，（±s）］

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與輕度子癇比較，#P＜0.01

組別樣本數(shù)RAGE mRNA輕度子癇前期 200.518±0.047*重度子癇前期200.903±0.054*#對(duì)照組200.276±0.031 F值23.482 P值0.000

3　討論

子癇前期是妊娠婦女特有的疾病，發(fā)病機(jī)制仍未闡明。有研究認(rèn)為妊娠本身就是一種輕度的炎癥反應(yīng)，但這種炎癥反應(yīng)不會(huì)引起母體的任何癥狀，但在子癇前期患者中，這種炎癥被過度放大，進(jìn)而引起一系列的癥狀。Hung等發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血中白細(xì)胞大量激活［3］，Medzhitov等發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦外周血炎性細(xì)胞因子水平升高［3］均支持這一觀點(diǎn)，子癇前期孕婦血清中CRP、IL-6、IL-8、MCP-1等炎性損傷標(biāo)志物水平較正常孕婦顯著升高。

RAGE是一種跨膜蛋白，最初在牛肺內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，屬于免疫球蛋白超家族，正常生理狀態(tài)下，RAGE的蛋白及mRNA含量均低表達(dá)，但在病理狀態(tài)下，局部RAGE配體堆積，可通過受體依賴的方式上調(diào)RAGE的表達(dá)，繼而通過受體與配體的結(jié)合，從而活化細(xì)胞，放大配體的生物學(xué)作用，最終引起細(xì)胞及組織的損傷［4］。

在本資料中，輕度子癇組和重度子癇組胎盤組織中RAGE蛋白均較正常胎盤組織中表達(dá)增高，RTPCR結(jié)果顯示輕度子癇組和重度子癇組RAGE mRNA表達(dá)水平同樣比對(duì)照組顯著升高，與高琳等實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［5］。表明RAGE可能在子癇前期的疾病發(fā)生過程中起到重要的作用。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)重度子癇前期RAGE蛋白及RAGE mRNA表達(dá)均較輕度子癇組升高，表明RAGE與疾病發(fā)生及病情嚴(yán)重程度可能存在關(guān)聯(lián)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 Schmidt AM， Hori O， Cao R， et al. RAGE， a novel cellular receptor for advanced glycation end products. Diabetes， 1996， 45（Suppl 3）： S77080.

2 樂杰（主編）. 婦產(chǎn)科學(xué). 第七版. 人民衛(wèi)生出版社. 2008.8.

3 Hung TH， Charnock-jones DS， Skepper JN， et al. Secretion of tumor necrosis factor-α from human placental tissues induced by hypoxiareoxygenation causes endothelial cell activation in vitro ： a potential mediator of the inflammatory response in preeclampsia. Am J Pathol，2004， 164（3）： 1049.

4 Schmidt AM， Yao SD， Yan SF， et al. The multiligand receptor RAGE as a progression factor amplifying immune and inflammatory response. J Clin Invest， 2001， 108（7）：945～955.

5 高琳，劉文輝，欒南南，等.高遷移率族蛋白1及其受體晚期糖基化終末產(chǎn)物的表達(dá)與子癇前期發(fā)病的關(guān)系.中華婦產(chǎn)科雜志，2008，43（10）：746～750.

314000 嘉興學(xué)院附屬嘉興市婦幼保健院（方姍 葛加美）

314000 浙江省嘉興市秀洲區(qū)婦幼保健院（孫建琦）