譚　燕

hsa-miR-144在肺結核中的表達及臨床意義

譚燕

目的 觀察hsa-miR-144在肺結核中的表達及臨床意義。方法 收集50例肺結核患者抗結核治療前及治療后的血液樣本，其中包括30例初治型及20例難治型肺結核，同時收集15例健康人員的血液標本，分別采用實時熒光定量 PCR（Q-PCR）檢測hsa-miR-144的表達。結果 hsa-miR-144在肺結核患者中的表達明顯高于健康人員，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。同時，肺結核患者經抗結核治療后hsa-miR-144表達顯著下降（P＜0.05），其中初治型肺結核患者中hsa-miR-144下降較難治型肺結核更為明顯（P＜0.05）。結論 hsa-miR-144表達與肺結核的發(fā)生及發(fā)展相關，其表達的檢測有助于肺結核的診斷及治療。

hsa-miR-144 肺結核 實時熒光定量 PCR

結核?。╰uberculosis）是一種較為常見的傳染性疾病，據(jù)報道稱近年來我國結核病發(fā)病率正逐漸上升，年發(fā)病人數(shù)已達100萬，因結核發(fā)病導致死亡的年均死亡人數(shù)可達5.4萬，病死率約為4.1/10萬［1］。然而，關于結核病的發(fā)病機制尚未完全清楚，目前研究認為結核病的發(fā)生主要與機體自身免疫調節(jié)功能低下或紊亂有關，為此，研究與結核病相關的分子標志物將具有重要的意義，結核病早期相關分子標志物的篩選將有助于結核病的診斷及治療。近年來，研究表明微小RNA（micoRNA， miRNA）的表達與多種疾病相關［2］；本資料旨在觀察hsa-miR-144在肺結核中的表達及其臨床意義。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集本院2012年3月至2013年12月的50例肺結核患者血液標本，其中包括30例初治型及20例難治型肺結核。初治型肺結核包括男19例，女11例；年齡12～28歲，平均年齡21.5歲。難治型肺結核包括男12例，女8例；年齡28～48歲，平均年齡33.5歲。所有肺結核患者均經痰抗酸桿菌涂片確診為陽性。判定標準為采用結核菌特異性酶聯(lián)免疫斑點試驗陽性，初治型肺結核而胸片未見明顯異常，而難治型肺結核中部分患者可見明顯結核病灶及肺纖維化。所有肺結核患者均經痰抗酸桿菌涂片及分離培養(yǎng)確診為陽性，并接受抗結核治療＞3個月同時，收集15例健康患者的血液標本。所有觀察對象均排除HIV、乙肝、丙肝等傳染病及其他自身免疫性疾病等。

1.2標本的收集、處理及RNA的提取 收集患者早晨空腹2ml外周靜脈血，加入肝素鋰抗凝，再進行分裝；取500μl全血加入Trizol，室溫靜置10min，充分裂解細胞；再加入100μl氯仿，劇烈振蕩20s，室溫放置10min，以12000r/min，于4℃離心機內離心10 min。取上層水相加入等體積異丙醇充分混勻，室溫放置5min，以12000r/min，于4℃離心機內離心10min。再以75%乙醇洗滌沉淀物2 次，室溫晾干，加入適量DEPC水充分溶解，取2μl檢測RNA濃度，其余置于-80℃保存。

1.3實時熒光定量 PCR（Q-PCR） 采用TAKARA生物公司的反轉錄-熒光定量PCR檢測試劑盒進行，其中miRNA反轉錄反應體系為10 μl，包括反轉錄緩沖混合物5 μl，總RNA 0.5μl，反轉錄酶1 μl，0.1% BSA 1μl，RNase Free水2.5 μl，。反應條件為37℃60min，85℃5min。熒光定量PCR反應體系為20 μl，其中包括cDNA 模板1μl，SYBR Greenl0μl，上、下游引物各1 μl，RNase Free水7μl。反應條件為預變性95℃12 s，變性和延伸95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，引物退火溫度60℃。其中hsa-miR-144引物序列為hsa-miR-144：5'-GCGCTACAGTATAGATGATGTAC-3'，以 U6 為內參照，引物均由深圳華大基因公司設計合成。以Folds=2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量，計算公式為：ΔΔCt=［ΔCt（目的基因）-Ct（U6）］觀察組-［ΔCt（目的基因）-Ct（（U6）］對照組。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

采用QPCR檢測50例肺結核患者治療前與15例健康人員中hsa-miR-144的表達，結果表明hsa-miR-144在肺結核患者中的平均表達量為（12.35±1.25），明顯高于健康患者中的表達量（8.35±0.85），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。同時，分析了結核患者抗結核治療前及治療后hsamiR-144的表達，結果顯示治療前、后hsa-miR-144的表達分別為（12.35±1.25）、（9.75±0.55），兩者差異亦具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，結合結核患者的類型，比較初治型患者及難治型患者治療前后hsamiR-144的表達，結果見表2，結果提示經治療后hsa-miR-144表達均顯著下降（P＜0.05），但初治型肺結核患者中hsa-miR-144下降較難治型肺結核更為明顯。

表1　hsa-miR-144在結核及健康患者中的表達（±s）

表1　hsa-miR-144在結核及健康患者中的表達（±s）

分組nhsa-miR-144表達量P值結核組5012.35±1.25＜0.01健康組158.35±0.85

表2　治療前后hsa-miR-144在結核患者中的表達（±s）

表2　治療前后hsa-miR-144在結核患者中的表達（±s）

分組n治療前治療后P值初治型3013.31±2.859.61±2.31＜0.05難治型2011.32±2.359.82±2.34＜0.05

3　討論

miRNA為內源性非編碼小分子RNA，長度一般為19～22nt，其主要通過參與轉錄后蛋白水平的調控，降解靶基因的mRNA或抑制其蛋白翻譯，從而調控靶基因的功能；其表達廣泛參與細胞分化、侵襲、增殖、凋亡、血管生成等，與多種疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA與機體的免疫功能相關，參與機體的固有免疫及適應性免疫。其中，研究證實miR-144-3p可通過抑制T細胞的增殖調節(jié)機體的抗結核免疫反應，其在肺結核患者中的表達量也相應高于肺正?；颊撸?］。此外，劉守江等［5］研究表明miRNA144-3p在結核潛伏感染者全血中的表達明顯高于活動性肺結核患者。因此，miRNA144表達與肺結核有關。

本資料結果顯示，hsa-miR-144在肺結核患者中的表達明顯高于健康人員，肺結核患者經治療后hsamiR-144表達水平明顯下降，其中初治型肺結核與難治型肺結核患者中hsa-miR-144表達水平均明顯下降，提示hsa-miR-144與肺結核的療效相關；同時，結果亦表明初治型肺結核患者經治療后，hsa-miR-144水平的下降較難治型肺結核更明顯，提示初治型肺結核中hsa-miR-144的表達對治療中更為敏感。因此，hsa-miR-144可作為肺結核診斷及療效評估的有效指標。

總之， hsa-miR-144表達與肺結核的發(fā)生及發(fā)展相關，其表達的檢測有助于肺結核的診斷及治療。但是，由于本資料納入的樣本量并不大，抽樣誤差的存在難以避免，大樣本量的重復性研究仍具有重要的意義。

1 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告.中國防癆雜志，2012，8（34）：485～508.

2 史玉倉，梁杰. miRNA 與腫瘤及其對瘢痕疙瘩作用研究進展. 齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2014，35（1）：107～109.

3 傅軍，吳雪英. 微小RNA與乳腺癌侵襲轉移關系的研究進展. 福建醫(yī)藥雜志，2014，36（1）：139～140.

4 Liu Y，Wang X，Jiang J，et al.Modulation of T cell cytokine production by miR-144 with elevated expression in patients with pulmonary tuberculosis. Mol Immunol，2011，48（ 9～10） ： 1084～1090.

5 劉守江，張帆，魏巍，等.結核潛伏感染者全血miR-144-3p、miR-146a-5p 的表達. 臨床肺科雜志，2013，18（7）：1270～1271.

325400 浙江省平陽縣人民醫(yī)院感染科