陳紅舟　查　瑤　周吉航　鄔賢鳳　何劍營(yíng)　劉曉光

液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV DNA及E6/E7 mRNA定量檢測(cè)篩查宮頸病變的臨床價(jià)值

陳紅舟查瑤周吉航鄔賢鳳何劍營(yíng)劉曉光

目的 探討液基細(xì)胞學(xué)（TCT）聯(lián)合HPV DNA及E6/E7 mRNA定量檢測(cè)在宮頸病變篩查中的價(jià)值。方法 同時(shí)對(duì)303例宮頸病變篩查的樣本行TCT和HPV DNA及E6/E7 mRNA定量檢測(cè)，分析這三種方法在宮頸病變篩查中異同之處。結(jié)果 TCT檢測(cè)細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性檢出率最低，HPV DNA陽(yáng)性檢出率比E6/E7mRNA陽(yáng)性檢出率稍高。受試者工作特征曲線（ROC）確定的最佳診斷臨界點(diǎn)為43.6 copies/ml。HPV E6/E7 mRNA對(duì)CIN2+診斷的靈敏度為87.5%［95% 可信區(qū)間（CI）： 47.3～99.7］，特異度為87.1%（95% CI，82.8～90.7）。結(jié)論 TCT和HPV DNA及E6/E7mRNA聯(lián)合檢測(cè)能夠提高對(duì)宮頸病變篩查的敏感性和特異性，對(duì)防治宮頸病變有較好的臨床價(jià)值。

宮頸病變 液基細(xì)胞學(xué) 人乳頭瘤病毒 E6/E7

宮頸癌是全球婦女中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。高危型人乳頭狀病毒（HPV）感染被認(rèn)為是宮頸病變及宮頸癌發(fā)生的必要因素［1］。目前，宮頸病變及宮頸癌篩查的常用方法有液基細(xì)胞學(xué)、HPV檢測(cè)。本文通過(guò)三種方法聯(lián)合檢測(cè)303例宮頸脫落細(xì)胞樣本，探討三種方法在宮頸病變篩查中的異同及其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　臨床資料

1.1一般資料 2012年8月至 2014年2月本院303例就診患者采集宮頸脫落細(xì)胞，年齡20～73歲，平均年齡（41±10）歲。排除無(wú)性生活史、妊娠期、月經(jīng)期、24h內(nèi)有性生活及3d內(nèi)有陰道上藥或陰道沖洗者。觀察對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀（ABI7500，USA）；冷光儀（科蒂亞生物技術(shù)有限公司，新鄉(xiāng)）；普通PCR儀 （RIO-RAD MyCycler580BR USA） ；HPV核酸定量檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；HPV E6/E7mRNA檢測(cè)試劑盒（科蒂亞生物技術(shù)有限公司，新鄉(xiāng)）。

1.3宮頸液基細(xì)胞學(xué)（TCT）檢測(cè) 宮頸脫落細(xì)胞采樣，采用美國(guó)liquid protest系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞學(xué)分類采用2001年國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)推薦的新TBS分類標(biāo)準(zhǔn)。

1.4HPV DNA定量檢測(cè) 提取宮頸脫落細(xì)胞基因組DNA，按試劑盒配制PCR反應(yīng)體系在ABI7500中進(jìn)行擴(kuò)增，熱循環(huán)條件：93℃2min，93℃45s；55℃60s（10個(gè)循環(huán)）；93℃30s，55℃45s（30個(gè)循環(huán)）。

1.5HPV E6/E7mRNA定量檢測(cè) 操作步驟：（1）用宮頸穩(wěn)態(tài)檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光）中裂解液將宮頸細(xì)胞裂解。（2）檢測(cè)緩沖液配置：1μl封閉反應(yīng)液+17μl裂解液+31μl ddH2O+1μl檢測(cè)探針。（3）布板：標(biāo)本（50μl）+標(biāo)本檢測(cè)緩沖液（50μl），用封條貼紙貼緊整塊板，放入55℃保溫箱保溫3.5h。（4）3步信號(hào)放大。（5）上冷光儀檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HPV DNA 和HPV E6/E7mRNA檢測(cè)分別聯(lián)合TCT檢測(cè)的比較 見(jiàn)表1。

表1　HPV DNA 和HPV E6/E7mRNA檢測(cè)分別聯(lián)合TCT檢測(cè)的比較（n）

2.2HPV DNA 與HPV E6/E7mRNA檢測(cè)方法一致性的比較 見(jiàn)表2。

表2　HPV DNA 與HPV E6/E7mRNA檢測(cè)方法一致性的比較（n）

2.3三種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出情況 見(jiàn)圖1。

圖1　三種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出情況

2.4HPV E6/E7 mRNA診斷CIN2+的ROC曲線 HPV E6/E7 mRNA對(duì)CIN2+（CIN2、CIN3和癌）的最佳診斷臨界點(diǎn)為43.6copies/ml，ROC曲線下面積為0.880［95%可信區(qū)間（CI）：0.838～0.914］。

2.5CIN2+篩檢效能分析 HPV E6/E7 mRNA對(duì)CIN2+診斷的靈敏度為87.5%［95% CI： 47.3～99.7］，特異度為87.1%（95% CI：82.8～90.7）。

3　討論

本資料中對(duì)303例篩查宮頸病變的樣本同時(shí)行TCT、HPV DNA 和HPV E6/E7mRNA三種方法的檢測(cè)。其中TCT檢測(cè)細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性檢出率最低，HPV DNA陽(yáng)性檢出率比E6/E7mRNA陽(yáng)性檢出率稍高。數(shù)據(jù)顯示TCT、HPV DNA 和E6/E7mRNA三種檢測(cè)方法間的比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)宮頸病變篩查均各自具有一定的臨床價(jià)值。TCT檢測(cè)與傳統(tǒng)巴氏涂片法相比提高了宮頸病變的檢出率，但仍有一定的局限性，TCT是對(duì)宮頸細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常則為宮頸病變較晚的階段，TCT在低度宮頸病變中符合率低，存在一定的假陰性率［2］。這可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中陽(yáng)性病變檢出較少的主要原因之一。此外，醫(yī)生取材部位是否準(zhǔn)確，以及對(duì)病變部位取材的深度以及病理醫(yī)生對(duì)病變程度的判斷經(jīng)驗(yàn)均可影響病理診斷結(jié)果。HPV DNA檢測(cè)已成為宮頸癌及癌前病變一種重要的篩查手段，聯(lián)合TCT檢測(cè)更是高效的宮頸癌前病變的篩查方案。有研究表明［3］，99.70%宮頸癌患者的病變組織中都存在HPV感染，若HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性，說(shuō)明有HPV的感染。HPV DNA在宮頸良性病變中主要以游離狀態(tài)存在，在惡性病變中以整合狀態(tài)為主。而HPV感染機(jī)體后，免疫正常的人群會(huì)將其清除，僅是暫時(shí)性的，一過(guò)性的感染，僅＜10%的人群才會(huì)整合，才會(huì)進(jìn)展［4］。具有轉(zhuǎn)錄活性的HPV基因組整合至宿主染色體是宮頸病變快速轉(zhuǎn)化為宮頸癌的標(biāo)志之一［5］。這意味著HPV DNA檢測(cè)可能檢出過(guò)多的臨床無(wú)意義感染，因此識(shí)別HPV DNA的持續(xù)性感染顯得尤為重要，而HPV E6/E7mRNA的檢測(cè)彌補(bǔ)了HPV DNA的缺陷。HPVE6/E7mRNA定量檢測(cè)是測(cè)定與宮頸細(xì)胞病變程度相關(guān)的病毒活動(dòng)指標(biāo)。HPVE6/ E7mRNA檢測(cè)技術(shù)是國(guó)際上HPV檢測(cè)試劑的最新一代檢測(cè)靶標(biāo)，對(duì)高危型的HPV病毒持續(xù)性感染婦女的診斷更具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值 。一些研究表明與DNA檢測(cè)相比較，mRNA檢測(cè)作為判斷HPV感染與病變進(jìn)展為宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的指標(biāo)更有效［6］。

總之，TCT檢測(cè)直觀、特異性好。HPV DNA檢測(cè)的敏感性更高，檢測(cè)陽(yáng)性提示細(xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)的HPV病毒存在。HPV E6/E7mRNA定量檢測(cè)的敏感性較高，檢測(cè)陽(yáng)性則提示HPV病毒基因已整合并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄翻譯。因此作者認(rèn)為將液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV DNA 和E6/ E7mRNA定量檢測(cè)能夠提高宮頸病變篩查的敏感性和特異性，對(duì)預(yù)測(cè)宮頸病變的發(fā)展趨勢(shì)，積極有效預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，以及早期及時(shí)治療宮頸癌均有較好的臨床價(jià)值。

1 Sn～ders PJ，Heideman DA，Meijer CJ.Methods for HPV de-tection in exfoliated cell and tissue specimens.APMIS，2010，118（6～7）：520～528

2 Smith J S， Lindsay L， Hoots B， et al. Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions：A meta-analysis update. International journal of cancer， 2007， 121（3）：621～632.

3 任美英， 王翠峰， 付玉華. HPVE6/E7mRNA 定量檢測(cè)技術(shù)及其在宮頸病變中的臨床應(yīng)用. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘 （電子版）， 2012，12（9）： 50.

4 趙倩穎， 郄明蓉. 高危型人乳頭瘤病毒 E6， E7mRNA 檢測(cè)篩檢宮頸癌的價(jià)值. 中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志， 2013， 29（10）： 837～840.

5 Molden T， Kraus I， Skomedal H， et al. PreTect? HPV-Proofer： realtime detection and typing of E6/E7 mRNA from carcinogenic human papillomaviruses. Journal of virological methods， 2007， 142（1）： 204～212.

6 Sotlar K， Selinka HC， Menton M， et al. Detection of human papillomavirus type 16 E6/E7 oncogene transcripts in dysplastic and nondysplastic cervical scrapes by nested RT-PCR. Gynecologic oncology， 1998， 69（2）： 114～121.

316000 浙江省舟山醫(yī)院