顏小榮　康德智　林元相　潘軍　吳喜躍　周杰　江常震　漆松濤

顱咽管瘤雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型的建立☆

顏小榮*康德智*林元相*潘軍△吳喜躍*周杰※江常震*漆松濤△

目的 初步建立顱咽管瘤雞胚絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane CAM）移植瘤模型，并評(píng)估移植瘤血管生成能力及細(xì)胞增殖能力。方法利用術(shù)中所得顱咽管瘤組織，異種移植到雞胚CAM表面，建立移植瘤模型。對(duì)移植瘤瘤體周圍CAM血管進(jìn)行測(cè)定，評(píng)估移植瘤CAM血管生成能力，同時(shí)利用免疫組化法以CD34標(biāo)記移植瘤微血管密度（microvessel density，MVD），以PCNA檢測(cè)移植瘤細(xì)胞增殖活性。結(jié)果 成功建立顱咽管瘤CAM移植瘤模型，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤成瘤率為47.14%，鱗狀上皮型顱咽管瘤成瘤率為43.33%，兩者無(wú)顯著差異（χ2=0.123，P=0.726）；造釉細(xì)胞型移植瘤瘤周CAM血管生成能力，微血管密度及細(xì)胞增殖活性均高于鱗狀上皮型移植瘤。移植瘤PCNA的表達(dá)與MVD（Pearson r=0.639，P＜0.001）及CAM血管評(píng)分（Spearman r=0.490，P= 0.001）呈正相關(guān)。結(jié)論 采用異位異種移植的方法可在雞胚CAM上建立顱咽管瘤移植瘤模型。移植瘤可不同程度地刺激CAM上血管生成，移植瘤自身可建立微循環(huán)，具有一定的增殖能力。

顱咽管瘤 雞胚絨毛尿囊膜 血管生成 增殖

顱咽管瘤（craniopharyngioma，CP）是兒童顱內(nèi)最常見(jiàn)的先天性腫瘤之一，多好發(fā)于鞍區(qū)，占顱內(nèi)腫瘤的3%左右［1］，在所有兒童顱內(nèi)腫瘤中約占5%～15%［2］。顱咽管瘤屬于良性腫瘤，但其臨床治療效果不佳，術(shù)后常伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，且易復(fù)發(fā)。目前，顱咽管瘤科研工作中尚缺乏穩(wěn)定的永生細(xì)胞系作為研究載體，已有動(dòng)物模型主要是利用原代細(xì)胞接種于裸鼠皮下進(jìn)行成瘤，但其仍存在成瘤率相對(duì)較低等缺陷。因此進(jìn)一步探索發(fā)展可靠實(shí)用的動(dòng)物模型對(duì)顱咽管瘤相關(guān)基礎(chǔ)研究的突破具有重要意義。雞胚絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）是雞胚進(jìn)行氣體交換的重要媒介。在雞胚開(kāi)始孵育后的4～5d，來(lái)源于尿膜的中胚層外層上皮與來(lái)源于外胚層的絨毛膜上皮融合，形成CAM［3］。由于在CAM的發(fā)展過(guò)程中，伴隨著旺盛的新生血管的產(chǎn)生及動(dòng)靜脈血管網(wǎng)形成，因此CAM模型是血管生成及抑制相關(guān)研究的理想模型。在本研究中，我們將顱咽管瘤組織移植到CAM上，通過(guò)體式顯微鏡下連續(xù)觀察移植瘤的生長(zhǎng)，對(duì)移植瘤刺激CAM血管生成的能力進(jìn)行觀察和半定量分析；同時(shí)采用免疫組化法以CD34標(biāo)記移植瘤微血管密度（microvessel density，MVD），以PCNA檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性。

1　材料與方法

1.1腫瘤組織的準(zhǔn)備 10例CP均取自南方醫(yī)院神經(jīng)外科顱咽管瘤手術(shù)新鮮標(biāo)本，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，7例為造釉細(xì)胞型（adamantinomatous craniopharyngioma，ACP），3例為鱗狀上皮型（squamous papillary craniopharyngioma，SPCP）。手術(shù)切取CP后迅速投入含有100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）當(dāng)中。在超凈臺(tái)中將CP剪成約1.5mm×1.5mm×1.5mm大小的組織塊4℃保存?zhèn)溆?，每例腫瘤標(biāo)本擬接種于10枚雞胚蛋中。

1.2雞胚的準(zhǔn)備及腫瘤的接種 實(shí)驗(yàn)所用胚蛋購(gòu)自廣州市粵禽育種有限公司，均為孵育7d齡粵黃雞受精雞蛋，進(jìn)行操作前用新潔爾滅浸泡胚蛋10min后，放置于孵育箱內(nèi)，溫度保持在37℃，濕度70%～80%。實(shí)驗(yàn)時(shí)將胚蛋置于操作蛋架上，使胚蛋鈍端朝上，用銼在鈍端最高處銼出一小口后，用眼科鑷將蛋殼及外層殼膜去除，形成一個(gè)1cm× 1cm大小缺口，暴露氣室，用洗耳球?qū)⒌袈湓跉馐覂?nèi)殼膜上的蛋殼碎片吹出。滴少許生理鹽水于氣室底面的內(nèi)層殼膜，待生理鹽水滲入內(nèi)層殼膜與CAM之間后，以顯微鑷輕挑殼膜褶皺處，將殼膜撕開(kāi)，剪除，暴露CAM。將CP組織接種于CAM上血管豐富處。用滅菌透明膠布封閉蛋殼開(kāi)口，放置于37℃孵育箱內(nèi)進(jìn)行孵育。

1.3移植瘤大體觀察及CAM血管生成測(cè)定 在體式顯微鏡下，對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)及瘤體周圍CAM血管生成情況進(jìn)行連續(xù)觀察并拍攝，在移植瘤接種后第5天（雞胚孵育第12天）周圍血管生長(zhǎng)達(dá)到高峰時(shí)期時(shí)進(jìn)行血管生成評(píng)分；評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Vu MT及Folkman J團(tuán)隊(duì)的研究［4，5］。根據(jù)移植瘤周圍CAM血管生成情況按逐級(jí)遞增原則，對(duì)所觀察樣本給予0-4分的評(píng)分：0分，移植瘤周圍CAM血管維持原始樹(shù)杈分枝狀，與植入時(shí)相比未見(jiàn)明顯與移植瘤有直接生發(fā)關(guān)系的血管增生；1分，移植瘤周圍發(fā)出少許細(xì)微血管；2分，移植瘤周圍血管較多，開(kāi)始出現(xiàn)以瘤體為中心呈放射狀生長(zhǎng)的血管；3分，放射狀血管生長(zhǎng)更加明顯，少部分血管呈充血狀。4分，以移植瘤為中心出現(xiàn)大量充血的輻射狀血管，形成車輪狀輻射血管及其分支交織而成的血管網(wǎng)絡(luò)［5，6］。

1.4組織學(xué)觀察移植瘤接種后第10天（雞胚孵育第17天），于體式顯微鏡下取下生長(zhǎng)于CAM上的移植瘤（圖1）。4%福爾馬林固定24h，常規(guī)石蠟包埋處理后進(jìn)行切片（厚度4μm）行HE染色，觀察腫瘤組織學(xué)特點(diǎn)。

1.5MVD及增殖活性檢測(cè)免疫組化二步法檢測(cè)CD34及PCNA的表達(dá)。以CD34單克隆抗體（1：50，ZM-0046，中衫金橋）及PCNA單克隆抗體（1: 400，ZM-0213，中杉金橋）標(biāo)記CD34蛋白及PNCA蛋白。采用奧林巴斯BX-51顯微鏡下裝配DP-71照相機(jī)在同一設(shè)置下對(duì)切片進(jìn)行攝像。以IMAGE-PRO PLUS 6.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)移植瘤蛋白表達(dá)進(jìn)行積分光密度（integrated option density，IOD）的分析。每個(gè)標(biāo)本選取3個(gè)連續(xù)切片進(jìn)行評(píng)分，每張切片選取5個(gè)連續(xù)高倍鏡視野進(jìn)行拍攝，取IOD平均值作為該樣本的最后評(píng)分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ACP及SPCP成瘤率比較采用χ2檢驗(yàn)，兩種病理類型間移植瘤CAM血管評(píng)分采用Wilcoxon W檢驗(yàn)，MVD及PCNA表達(dá)強(qiáng)度比較采用Student-t檢驗(yàn)，PCNA與MVD和CAM血管評(píng)分相關(guān)性分別采用Pearson及Spearman相關(guān)性分析。檢測(cè)水準(zhǔn)α= 0.05。

圖1　移植瘤接種后第10天（雞胚孵育第17天）連膜剪下的移植瘤

2　結(jié)果

2.1移植瘤觀察移植后第1天（24h，雞胚孵育第8天）可見(jiàn)腫瘤貼附于CAM上生長(zhǎng)，腫瘤表面較不平整，周圍少許血管生成（圖2A）；移植后第3天（72h，雞胚孵育第10天）腫瘤表面開(kāi)始變得平整，稍隆起，顯示腫瘤瘤體開(kāi)始生長(zhǎng)。腫瘤周圍血管較前增加，并開(kāi)始呈輻射狀生長(zhǎng)（圖2B），部分移植瘤周圍可見(jiàn)新鮮出血點(diǎn)，此系雞胚胎體活動(dòng)，牽拉致使腫瘤血管破裂引起。移植后第5天（120h，雞胚孵育第12天），瘤體表面圓鈍，飽滿，整體隆起呈半圓球形；移植瘤周圍CAM血管生長(zhǎng)達(dá)到高峰，常見(jiàn)血管充血，呈車輪狀向外輻射生長(zhǎng)（圖2C）。此后瘤體及周圍血管均不再發(fā)生明顯變化，維持穩(wěn)態(tài)。

圖2　體式顯微鏡下同一移植瘤連續(xù)觀察A：移植后24h:未見(jiàn)與移植瘤有明顯直接關(guān)系的血管生成；B：移植后72h：移植瘤體積較前增大，出現(xiàn)少量發(fā)至移植瘤的放射狀生長(zhǎng)的血管；C：移植后120h：移植瘤體積明顯增大，呈半球形，出現(xiàn)以移植瘤為中心出現(xiàn)大量放射狀充血血管（×20）

2.2HE染色ACP移植瘤光鏡下可見(jiàn)典型柵欄狀排列細(xì)胞及內(nèi)層星網(wǎng)狀細(xì)胞層，部分移植瘤可見(jiàn)角質(zhì)，鈣化成分，但少見(jiàn)典型漩渦狀細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)可見(jiàn)內(nèi)含有雞有核紅細(xì)胞的血管生長(zhǎng)于腫瘤周圍（圖3 A，B）。SPCP主要以排列較為緊密的成熟鱗狀上皮為主，與絨毛膜分界較為清楚，局部可見(jiàn)壞死灶（圖3 B）。

圖3　A:ACP移植瘤HE染色，可見(jiàn)典型柵欄狀細(xì)胞層（星號(hào)）及其內(nèi)層星網(wǎng)狀細(xì)胞，腫瘤周圍可見(jiàn)豐富的CAM血管的生成（箭頭）；B:SPCP移植瘤HE染色，可見(jiàn)成熟鱗狀上皮層（星號(hào)）及腫瘤周圍CAM血管（箭頭）（×400）

2.3移植瘤微血管密度及增殖活性測(cè)定 以CD34單克隆抗體標(biāo)記移植瘤MVD（圖4）。免疫組化結(jié)果顯示ACP的腫瘤實(shí)質(zhì)部分及間質(zhì)部分均可見(jiàn)有微血管生成，SPCP的染色主要出現(xiàn)在腫瘤間質(zhì)，腫瘤實(shí)質(zhì)中少見(jiàn)新生血管染色。

圖4　A:ACP移植瘤中CD34的表達(dá)；B:SPCP移植瘤中CD34的表達(dá)（×400）

PCNA為細(xì)胞核染色，ACP移植瘤中，PCNA主要強(qiáng)表達(dá)于柵欄狀細(xì)胞，該層細(xì)胞常處于移植瘤的最外層（圖5A）；SPCP中PCNA強(qiáng)表達(dá)區(qū)也位于與CAM膠原層交界的乳頭狀上皮區(qū)域，而在其內(nèi)層的上皮中PCNA的表達(dá)則相對(duì)較弱（圖5B）。

2.4CAM瘤周血管評(píng)分 在移植后第5天（雞胚孵育第12天）移植瘤表面CAM血管生長(zhǎng)達(dá)到高峰，血管生成分析顯示ACP移植瘤周圍CAM血管評(píng)分 3.0（3.0，4.0）明 顯 高 于 SPCP2.0（1.5，2.0）（Z=-3.862，P＜0.001）。

2.5移植瘤存活率、MVD及增殖活性比較 ACP移植瘤存活率47.14%（33/70），SPCP移植瘤存活率43.33%（13/30），二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.123，P= 0.726）；ACP的血管活性指標(biāo)CD34（MVD）及增殖活性指標(biāo)PCNA的表達(dá)均高于SPCP（tCD34=4.809；tPCNA=5.470，P＜0.001，表1）。相關(guān)性分析結(jié)果表明移植瘤PCNA的表達(dá)與MVD（Pearsonr=0.639，P＜0.001）及CAM血管評(píng)分 （Spearmanr=0.490，P= 0.001）呈正相關(guān)。

圖5　A:ACP中PCNA強(qiáng)表達(dá)于外圍柵欄狀細(xì)胞層（箭頭）；B:SPCP中PCNA強(qiáng)表達(dá)于交界區(qū)的乳頭狀上皮（箭頭）（×400）

3　討論

3.1移植瘤大體觀察及組織學(xué)特點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)中我們將7例ACP及3例SPCP接種于CAM上，每例標(biāo)本接種于10枚雞胚蛋中，ACP移植瘤存活率47.14%（33/70），SPCP移植瘤存活率43.33%（13/ 30）。組織學(xué)上，ACP基本保持了其原有的特點(diǎn)，光鏡下可見(jiàn)典型的柵欄樣細(xì)胞排列及內(nèi)層星網(wǎng)狀細(xì)胞，但少見(jiàn)典型的旋渦狀結(jié)構(gòu)，這可能與腫瘤接種時(shí)間較短細(xì)胞未及分化到該階段有關(guān)。SPCP則基本維持了其成熟復(fù)層鱗狀上皮為主的結(jié)構(gòu)，常見(jiàn)的壞死灶可能是由于SPCP移植瘤中新生血管的生成較少導(dǎo)致腫瘤得不到充足養(yǎng)分所致。

我們對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行連續(xù)觀察及并對(duì)瘤周CAM血管生成進(jìn)行連續(xù)拍攝。在移植24h之后，腫瘤周圍CAM表面可見(jiàn)少許細(xì)微的血管生成，顯示此時(shí)的瘤體可能已經(jīng)初步與CAM建立血供關(guān)系。此后幾天，隨著腫瘤周的血管生成的不斷增加，腫瘤的體積亦開(kāi)始增大，表面逐漸由移植初期的不規(guī)則狀態(tài)變得較為平整。到移植后的第4～5 d（雞胚周期第11～12 d）移植瘤體積較前明顯增大，表面變得光滑，圓鈍，常呈半球形突出于CAM表面。同時(shí)移植瘤周圍CAM表面血管增殖達(dá)到高峰，之后不再明顯增加，這與雞胚CAM在自然條件下的血管網(wǎng)成熟時(shí)間是一致的。

3.2移植瘤MVD及增殖活性分析 腫瘤的血管生成能力是衡量腫瘤生長(zhǎng)的重要指標(biāo)。Vidal S等［6］研究表明顱咽管瘤的血管生成能力與其預(yù)后之間存在密切的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)中我們利用對(duì)CAM表面血管增生能力進(jìn)行的測(cè)定及并檢測(cè)移植瘤MVD，對(duì)顱咽管瘤移植瘤宏觀和微觀的血管形成能力做綜合的分析。

有研究發(fā)現(xiàn)包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α TNF-α）等在內(nèi)的多種外源性促血管生成因子可刺激CAM表面血管的增生［7，8］。本實(shí)驗(yàn)中，隨著腫瘤的生長(zhǎng)，移植瘤周圍的CAM血管亦隨之出現(xiàn)不同程度的增生，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示ACP的CAM血管生成評(píng)分高于SPCP。這說(shuō)明CP移植瘤可能通過(guò)釋放某些促血管生的因子促進(jìn)了CAM表面血管的生長(zhǎng)，并且這種能力在不同類型CP之間存在差異。在CD34抗體標(biāo)記移植瘤MVD實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)ACP的MVD高于SPCP，表明ACP移植瘤微循環(huán)構(gòu)建能力強(qiáng)于SPCP。這與Xu等［9］通過(guò)檢測(cè)常規(guī)組織病理切片發(fā)現(xiàn)ACP的MVD高于SPCP的結(jié)論是一致的。

PCNA是一種細(xì)胞增殖抗原，可作為檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)［10］。本研究中，ACP的PCNA表達(dá)要高于SPCP，且在兩個(gè)病理亞型中PCNA的強(qiáng)表達(dá)區(qū)域都是位于腫瘤最外層與CAM膠原層的交界區(qū)，而位于腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞表達(dá)則相對(duì)較弱，顯示腫瘤外圍的細(xì)胞的增殖活性更強(qiáng)，這與我課題組之前的研究中發(fā)現(xiàn)PCNA強(qiáng)表達(dá)于顱咽管瘤外圍乳頭狀細(xì)胞層及漩渦狀細(xì)胞中而腫瘤內(nèi)層細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較弱的結(jié)果相同，說(shuō)明在CAM上生長(zhǎng)的CP移植瘤的增殖性狀未發(fā)生明顯改變［11］。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示移植瘤PCNA與MVD的表達(dá)和CAM血管評(píng)分呈正相關(guān)，推測(cè)可能是由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)越活躍，其分泌促血管生長(zhǎng)因子的能力也越強(qiáng)，血管生成豐富反過(guò)來(lái)又可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

表1　ACP與SPCP之間，MVD及PCNA檢測(cè)的差異比較

3.3CAM移植瘤模型特點(diǎn)分析 CAM模型是研究腫瘤生物學(xué)性狀尤其是血管生成能力的重要模型之一。其主要的優(yōu)點(diǎn)有：①與傳統(tǒng)的裸鼠模型相比，雞胚CAM模型可在不終止移植瘤生長(zhǎng)的情況下，對(duì)腫瘤瘤體的生長(zhǎng)情況進(jìn)行連續(xù)觀察并對(duì)移植瘤周圍血管生成進(jìn)行半定量評(píng)估；②顱咽管瘤屬于良性腫瘤（WHO，Ⅰ級(jí)），目前尚無(wú)永生的細(xì)胞系，這可能與其生長(zhǎng)對(duì)周圍微環(huán)境的要求較高有關(guān)，雞胚的天然低免疫性為其提供了一個(gè)合適的生存平臺(tái)，同時(shí)CAM表面血管網(wǎng)密集，血供極為豐富，保證了顱咽管瘤移植瘤具有較高的存活率；③CAM的內(nèi)外兩層皆為復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞層，與人體內(nèi)某些生物膜的性狀具有一定的相似性，相比其他模型其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單明了，可以較為直觀地從組織學(xué)角度上判斷腫瘤與生物膜之間的關(guān)系，遠(yuǎn)期此模型有望用于腫瘤侵襲或遷徙相關(guān)研究；④由于CAM模型的載體成本遠(yuǎn)比裸鼠來(lái)的低，且具有試驗(yàn)周期短，可重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此比傳統(tǒng)的動(dòng)物模型更適用于腫瘤樣本的大規(guī)模篩查實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然這一模型也存在一定的缺陷，由于雞胚孵育的17d開(kāi)始具有較強(qiáng)的自身免疫能力，可能不利于腫瘤的生長(zhǎng)，因此研究周期較短，這也是本實(shí)驗(yàn)中，我們于孵育17d時(shí)取下移植瘤進(jìn)行組織學(xué)分析的原因；CAM血管的增生有一定的限度，在孵育12d以后CAM血管增殖達(dá)到頂峰，移植瘤的生長(zhǎng)也因此進(jìn)入相對(duì)緩慢的狀態(tài)，我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)SPCP移植瘤局部?？梢?jiàn)壞死灶，推測(cè)可能由于SPCP移植瘤對(duì)血供要求較高，CAM血管增殖達(dá)到平臺(tái)期后不能繼續(xù)滿足腫瘤快速生長(zhǎng)所致。

本實(shí)驗(yàn)首次利用雞胚CAM，成功建立了顱咽管瘤異體移植瘤模型，移植瘤具有一定的增殖活性，基本保持了原有的組織學(xué)特點(diǎn)。該模型便于對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行連續(xù)地直接觀察，能利用CAM表面血管生成的半定量分析和MVD檢測(cè)對(duì)移植瘤血管生成能力進(jìn)行綜合分析，且操作簡(jiǎn)單，成本較低，是一種可作為顱咽管瘤相關(guān)基礎(chǔ)研究的理想模型。

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The establisment of human craniopharyngioma xenografts in chick chorioallantoic membrane.

YANXiaorong，KANG Dezhi，LIN Yuanxiang，PAN Jun，WU Xiyue，ZHOU Jie，JIANG Changzhen，QI Songtao.Department of Neurosurgery，Nanfang Hospital，Southern Medical University，1838#Guangzhou Road Guangzhou City，Guangzhou 510515，China.Tel:020-61641801.

Objective To establish the xenotransplanted tumor model of Craniopharyngioma in chick chorioallantoic membrane（CAM）and detect the angiogenesis ability，microvessel density（MVD）and cell proliferation of the xenograft.Method Craniopharyngioma tissues from surgical craniopharyngioma patients were transplanted on the CAM.Angiogenesis assay was performed and the MVD and PCNA were evaluated using immunohistochemistry following the transplantation.Results The tumor formation rate of adamantinomatous craniopharyngioma（ACP）and squamous papillary craniopharyngioma（SPCP）was 47.14%and 43.33%，respectively.There was no significant difference in tumor formation rate between ACP and SPCP（χ2=0.123，P=0.726）.The CAM angiogenesis，MVD and expression of PCNA were higher in ACP than in SPCP.The expression of PCNA was positively correlated with MVD（Pearson r=0.639，P＜0.001）and CAM assay score（Spearman r=0.490，P=0.001）in CP.Conclusion The model of human craniopharyngioma can be established in the CAM.The angiogenesis of the xenograft in the CAM can be evaluated and the craniopharyngioma xenograft of CAM possesses a new blood circulation and cell proliferation ability.

Craniopharyngioma Chick chorioallantoic membrane Angiogenesis Proliferation

R739.41

A

2015-08-20）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.11.003

☆ 福建省衛(wèi)計(jì)委青年科研項(xiàng)目（編號(hào)：2014-2-21）；福建省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2015J05150）

*福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科（福州 350005）

△南方醫(yī)院神經(jīng)外科

※四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科