馬可　陳雄　鄭俊炯　陳嘉誠　豐巖清

多發(fā)性硬化動物模型神經(jīng)功能評分的比較與改良

馬可*陳雄*鄭俊炯*陳嘉誠*豐巖清*

目的探討三種神經(jīng)功能評分方法在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型中的應用情況，并提出最適評價標準。方法 32只雌性C57BL/6小鼠（18～20 g）隨機分配為正常對照組（15只）、造模組（17只）。造模組用MOG33-35多肽與弗式完全佐劑等體積混合成乳劑后多點皮下注射制備成EAE模型。遵循雙人雙盲原則分別使用Kono’s 5分法、Weaver’s 15分法及改良15分法進行神經(jīng)功能評分，并結(jié)合小鼠脊髓H&E染色結(jié)果，探究三種評分方法的評價準確性、癥狀敏感性、病情相關性。結(jié)果據(jù)神經(jīng)功能評分趨勢圖，改良15分法后期癥狀波動更明顯。對于非典型性發(fā)病EAE，改良15分法和15分法的評分更準確。改良15分法和15分法的發(fā)病時間顯著早于5分法（P＜0.001），且可反映早期病理改變。改良15分法與高峰期、緩解期病理改變顯著相關（高峰P=0.001，緩解P=0.024），15分法與緩解期病理改變相關（P＜0.05）。結(jié)論在實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型中，改良15分法能有效進行細化評分，更準確地評估各時期神經(jīng)功能改變。

多發(fā)性硬化 實驗性自身免疫性腦脊髓炎 神經(jīng)功能評分方法

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是國際上公認的多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的理想動物模型，因能復制出與MS相似的臨床表現(xiàn)和病理特征而被廣泛應用，并成為研究MS發(fā)病機制和藥物治療臨床前試驗的重要手段［1-4］。

典型慢性EAE小鼠模型主要表現(xiàn)為運動功能障礙，對其據(jù)神經(jīng)功能評分標準量化后所得分數(shù)可反映患病程度。但針對此EAE模型，目前仍沒有統(tǒng)一的神經(jīng)功能評分方法，常用的評分標準有Kono’s 5分法、Hooper’s 7分法和Weaver’s 15分法［5-6］。其中又因Hooper’s 7分法被多次更改，而最常用Kono’s 5分法和Weaver’s 15分法。但由于5分法適用面受限且評分不夠細化、15分法的評分標準表述缺乏精準性，導致兩種方法的對模型病情反映欠準確、對病情變化反映欠敏感。因此，本研究基于對EAE模型的長期觀察提出了改良15分法。本文從評分方法的評價準確性、癥狀敏感性、病情相關性三個方面對Kono’s 5分法，Weaver’s 15分法和改良15分法進行探究，并提出EAE模型的相對最適神經(jīng)功能評分方法。

1　材料與方法

1.1實驗動物 8～10周齡的C57BL/6雌性小鼠，體重18到20 g，購自中山大學實驗動物中心（廣東），飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心。

1.2EAE模型制備 C57BL/6小鼠飼養(yǎng)1周后用于實驗，記為第0天。32只8～10周齡的C57BL/6雌性小鼠隨機分為正常對照組（15只）、造模組（17只）。第0天，將100 μL 2mg/mL MOG33-35（MEVGYRSPFSRVVHLYRNGK，西安聯(lián)美多肽有限公司）和100 μL弗氏完全佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA；美國Sigma公司）混合制成乳劑，多點皮下注射于造模組制備EAE模型；同時正常對照組皮下注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）。第0天及第2天，造模組腹腔注射百日咳毒素（pertussis toxin，PTX；美國Sigma公司）300 ng/只。第7天，造模組再次注射乳劑進行二次免疫，造模方法同上；對照組附以PBS注射作對照。

1.3神經(jīng)功能評分標準

1.3.1Kono’s 5分法 5分法（Kono，1988）［5-6］按照癥狀嚴重程度分為5個級別：0分為不發(fā)病；1分為尾巴無力；2分為后肢無力；3分為后肢癱瘓；4分為前肢癱瘓；5分為死亡。

1.3.2Weaver’s 15分法 15分法（Weaver，2005）［5-6］是對小鼠尾巴和四肢進行評分，再將得到的5個分數(shù)累加即得到總分。對于尾巴，0分表示無癥狀，1分表示尾巴半癱，2分表示尾巴全癱；對于四肢，0分表示無癥狀，1分表示無力或步態(tài)改變，2分表示肢體輕癱，3分表示肢體全癱。如此，發(fā)病最重的小鼠即尾巴全癱和四個肢體全癱則應評為14分（2’+3’×4），15分則表示死亡。

1.3.3改良15分法改良15分法是本研究基于Weaver’s 15分法做進一步細化，將小鼠尾巴和四肢進行評分，再將得到的5個分數(shù)累加即得到總分。對于尾巴（見圖1），0分表示無癥狀，0.5分表示比正常稍低，1分表示與地面平行，1.5分表示尾尖拖地，2分表示全尾拖地；對于肢體，0分表示正常，0.5分表示四肢掌外翻，1分表示四肢掌外翻且身體相應部位稍壓低，1.5分表示四肢掌外翻且身體相應部位幾乎貼地，2分表示輕癱（行走時有關節(jié)活動），3分表示全癱（肢體不能活動，行走時拖著肢體）。如此，發(fā)病最重的老鼠即尾巴全癱和四個肢體全癱則評為14分（2’+3’×4），15分則表示死亡。

1.4評分方法 神經(jīng)功能評分方法嚴格遵循雙人雙盲原則，于每日9點對32只小鼠進行觀察評分，對每只老鼠使用兩種評分方法，且同一小鼠的兩次評分時間差控制在20 min以上。

1.5病理改變分析 動物取材時間及數(shù)量：①發(fā)病初期：EAE組小鼠（5分法評分=0，15分法、改良15分法評分=0.5）及正常組小鼠各3只；②發(fā)病中期：主發(fā)癥狀不同的EAE組小鼠（分別以“前肢輕癱”和“后肢無力”為主）各1只；③發(fā)病高峰期：EAE組小鼠、正常組小鼠各9只；④疾病緩解期：EAE組小鼠、正常組小鼠各3只。

動物取材方法：用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，剖開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室刺入注射器，剪開右心耳，灌注生理鹽水，沖洗血液至肝臟變白后，改用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定0.5～1 h，然后取出腰骶段脊髓浸入4%多聚甲醛液中固定24 h。濾紙將組織表面的多聚甲醛吸干后制作石蠟切片，厚度為5 μm。進行后續(xù)H&E染色，光鏡下觀察炎性細胞浸潤。

H&E染色評分標準：參照Racke的病理分度標準（400倍鏡下計數(shù)）［7］—0分：沒有炎癥細胞；1分：少量散在的炎癥細胞；2分：在血管周圍組織見炎性浸潤；3分：見大量血管套現(xiàn)象并向鄰近組織延伸，或者組織炎性浸潤但不伴有血管套現(xiàn)象。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示。三種評分方法與病情的相關性分析采用Pearson相關系數(shù)。檢驗水準α= 0.05。

2　結(jié)果

2.1三種評分方法評價準確性比較

2.1.1神經(jīng)功能評分總體趨勢 EAE組小鼠全部發(fā)病，表現(xiàn)為食欲不振，體重減輕，精神萎靡，步態(tài)失常，活動減少，并伴有不同程度的尾巴無力、四肢無力等癥狀。由神經(jīng)功能評分曲線圖（見圖2）可得：①第4至6天，EAE組逐漸起病；15分法、改良15分法的平均癥狀評分=0.5，而5分法的平均癥狀評分仍為0（5分法的最小有癥狀評分為1分）；②第7天開始，EAE組小鼠全部患病；③第17天，EAE組小鼠病情達峰，且改良15分法的癥狀峰值最明顯；④第17至35天，EAE組病情趨于穩(wěn)定；⑤與5分法和15分法相比，改良15分法后期癥狀評分波動較為明顯，能更準確地反映模型病情的變化。

圖2　三種評分方法評分與免疫天數(shù)曲線圖

2.1.2EAE模型特例的癥狀描述EAE模型的典型發(fā)病模式為“尾部—后肢—前肢”。而第18天EAE組出現(xiàn)1只非典型性發(fā)病小鼠，其呈現(xiàn)“尾部—前肢”的疾病進展模式，即僅有尾巴無力、前肢輕癱，運動障礙癥狀未波及后肢等其他部位。取此鼠（以“前肢輕癱”為主）與同組常規(guī)發(fā)病鼠（以“后肢無力”為主）的全段脊髓做病理H&E染色，對比二者炎癥浸潤最明顯脊髓節(jié)段的病理情況。結(jié)果顯示，與正常對照（見圖5）相比，兩只EAE鼠脊髓白質(zhì)均見明顯的炎性浸潤（見圖3）；而對比兩只“5分法得分各異、15分法與改良15分法得分相同”的EAE鼠（見表1），H&E染色結(jié)果未出現(xiàn)明顯差異。

表1　三種神經(jīng)功能評分方法的神經(jīng)功能評分比較

由此說明，對于非典型性發(fā)病的EAE模型，與5分法相比，15分法和改良15分法的癥狀描述準確性較高。

2.2三種評分方法癥狀敏感性比較

2.2.1EAE模型發(fā)病時間基于三種神經(jīng)功能評分標準，15分法與改良15分法的發(fā)病時間（均為4.20±0.25 d）比5分法的發(fā)病時間（6.30±0.37 d）顯著提前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；見圖4）。結(jié)果說明與5分法相比，15分法與改良15分法更有利于早期發(fā)現(xiàn)EAE模型的癥狀改變。

2.2.2EAE模型發(fā)病早期病理改變?yōu)檫M一步探究三種評分方法對EAE模型早期癥狀發(fā)現(xiàn)的敏

圖3　主發(fā)癥狀不同的EAE模型脊髓（炎癥浸潤最明顯節(jié)段）病理切片（HE，400×）

圖4　三種神經(jīng)功能評分方法的發(fā)病時間（***表示與5分法相比，P＜0.001）

圖5　EAE模型（15分法、改良15分法=0.5，5分法=0）與正常組腰骶段脊髓病理切片（HE，400×）

2.3三種評分方法病情相關性比較

2.3.1發(fā)病高峰期三種評分方法的病情相關性比較根據(jù)三種神經(jīng)功能評分標準，預實驗結(jié)果顯示改良15分法的發(fā)病高峰時間（17.00±0.98）d遲于5分法的高峰時間（15.20±0.89）d、15分法的高峰時間（13.50±1.06）d，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，見圖6）。

圖6　三種神經(jīng)功能評分方法的發(fā)病高峰時間（###表示與5分法、15分法相比，P＜0.001）

基于上述結(jié)果，分別于第14、15、17天（分別對應15分法、5分法、改良15分法的高峰期）取小鼠腰骶段脊髓進行H&E染色觀察，并參照Racke的病理分度標準評分。再據(jù)三種評分方法高峰期評分與脊髓病理評分進行Pearson相關分析（見表2）顯示，5分法、15分法與病理評分相關性無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），改良15分法與病理改變顯著相關（P=0.001，γ=0.709）。

表2　三種神經(jīng)功能評分方法的病情相關性比較（高峰期）

2.3.2疾病緩解期三種評分方法的病情相關性比較免疫后第35天取小鼠腰骶段脊髓進行H&E染色觀察，并參照Racke的病理分度標準評分。再據(jù)三種評分方法高峰期評分與脊髓病理評分進行Pearson相關分析（見表3）顯示，5分法與病理感性，免疫后第4天處死EAE組（15分法、改良15分法評分=0.5，5分法評分=0）與正常對照組小鼠各3只，并取腰骶段脊髓做H&E染色觀察病理改變。如圖5所示，與正常小鼠相比，EAE組可見脊髓白質(zhì)炎癥細胞浸潤。這進一步說明與5分法相比，15分法和改良15分法對早期癥狀的發(fā)現(xiàn)更敏感。評分相關性無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），15分法、改良15分法均與病理改變顯著相關（P＜0.05）。

表3　三種神經(jīng)功能評分方法的病情相關性比較（緩解期）

3　討論

EAE模型作為研究多發(fā)性硬化的主要動物模型被廣泛使用，但目前對其仍沒有統(tǒng)一的神經(jīng)功能評分方法。其中最常用的評分方法包括Kono’s 5分法、Hooper’s 7分法以及Weaver’s 15分法。而對于Kono’s 5分法又描述各異［8-9］，7分法也被改進成8分法、9分法等［10-11］。這些方法都有其存在的合理性，但由于缺少統(tǒng)一且行之有效的評分標準而造成了學術交流的不便。因此，本研究在15分法的基礎上做出改良，并對5分法，15分法和改良15分法在EAE模型的應用情況進行比較，試圖找到最適評價標準。

多發(fā)性硬化癥病灶具有時間多發(fā)性，其動物模型EAE也具有復發(fā)—緩解的特點。本研究顯示，對比常用的5分法和15分法，評分標準經(jīng)過合理細化的改良15分法可以更準確地評估EAE模型癥狀的波動情況。多發(fā)性硬化癥病灶還具有空間多發(fā)性，其動物模型EAE的起病部位也并不固定，因此5分法的模型適用范圍嚴重受限。如本研究中出現(xiàn)的非典型性發(fā)病模型（以“前肢輕癱、后肢不受累”為主發(fā)癥狀）與同期常規(guī)型發(fā)病模型（以“后肢無力”為主發(fā)癥狀）相比，二者病理改變評分并無統(tǒng)計學差異，但用5分法評價得到的神經(jīng)功能評分卻出現(xiàn)了較大的區(qū)別。這充分說明了5分法沒能有效地考慮EAE模型病灶有空間多發(fā)性的特點。而改良15分法和15分法采用分數(shù)累加的計分方法，尤其是改良15分法又做了進一步的評分細化，這很有效的解決了病灶隨發(fā)導致行為表現(xiàn)差異的問題。

此外，改良15分法和15分法的早期癥狀發(fā)現(xiàn)敏感性顯著優(yōu)于5分法。如圖4所示，改良15分法和15分法的發(fā)病時間明顯早于5分法，差異有統(tǒng)計學意義。且病理分析也驗證了改良15分法和15分法早期發(fā)現(xiàn)的準確性。在藥物治療臨床前試驗中，15分法，尤其是評分細化后的改良15分法在研究藥物對EAE模型早期變化的有效性方面具有顯著的優(yōu)勢。

同時，我們也對三種評分方法的與病理改變的相關性進行了研究。結(jié)果表明，在EAE緩解期，改良15分法和15分法與病理改變顯著相關。這在關于多發(fā)性硬化癥緩解復發(fā)過程的研究具有顯著優(yōu)勢。而在EAE高峰期，改良15分法與病理改變顯著相關，15分法和5分法與病理評分相關性無統(tǒng)計學意義。高峰期在關于EAE模型的研究中是一個常用于觀察的病理階段，一般的研究中該階段的確定主要是通過神經(jīng)功能評分方法評分結(jié)果來確定，所以，該時期神經(jīng)功能評分方法評分是否準確十分重要。所以，我們有理由相信改良15分法在未來的科研工作中會可以發(fā)揮巨大的作用。

本研究仍存在一些不足之處。首先，本研究中非典型性發(fā)病的模型數(shù)量有限，尚未得到更加全面的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)。其次，本研究僅僅對將改良的15分法與常用的5分法和15分法進行比較，沒有將其與常用的7分法進行比較，不能客觀得出改良15分法優(yōu)于其他所有神經(jīng)功能評分方法。最后，改良15分法是我們根據(jù)前人的努力成果以及實驗經(jīng)驗而提出的，相比5分法和15分法都有了較大的提高，但它仍然還有進一步提高的空間。希望其他科研工作者也能對此進行研究，分享經(jīng)驗，提出更加準確、敏銳、病理相關性更好的評分方法。

［1］Friese MA，Montalban X，Willcox N，et al.The value of animal models for drug development in multiple sclerosis［J］.Brain，2006，129（8）:1940-1952.

［2］Hickey WF.The pathology of multiple sclerosis:a historical perspective［J］.J Neuroimmunol，1999，98（1）:37-44.

［3］Hafler DA.Multiple sclerosis（vol 113，pg 788，2004）［J］.Journal of clinical investigation，2004，113（7）:1070.

［4］Guo MF，Ji N，Ma CG.Immunologic pathogenesis of multiple sclerosis［J］.Neurosci Bull，2008，24（6）:381-386.

［5］Urban JL，Kumar V，Kono DH，et al.Restricted use of T cell receptor V genes in murine autoimmune encephalomyelitis raises possibilities for antibody therapy［J］.Cell，1988，54（4）:577-592.

［6］Taylor AW，Kitaichi N.The diminishment of experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）by neuropeptide alpha-melanocyte stimulating hormone（alpha-MSH）therapy［J］.Brain Behav Immun，2008，22（5）:639-646.

［7］Racke MK，Bonomo A，Scott DE，et al.Cytokine-induced immune deviation as a therapy for inflammatory autoimmune disease［J］.J Exp Med，1994，180（5）:1961-1966.

［8］Dijkstra S，Kooij G，Verbeek R，et al.Targeting the tetraspanin CD81 blocks monocyte transmigration and ameliorates EAE［J］. Neurobiol Dis，2008，31（3）:413-421.

［9］Kuerten S，Javeri S，Tary-Lehmann M，et al.Fundamental differences in the dynamics of CNS lesion development and composition in MP4-and MOG peptide 35-55-induced experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Clin Immunol，2008，129（2）: 256-267.

［10］Polfliet MM，van de Veerdonk F，Dopp EA，et al.The role of perivascular and meningeal macrophages in experimental allergic encephalomyelitis［J］.J Neuroimmunol，2002，122（1-2）:1-8.

［11］Schaecher K，Rocchini A，Dinkins J，et al.Calpain expression and infiltration of activated T cells in experimental allergic encephalomyelitis over time:increased calpain activity begins with onset of disease［J］.J Neuroimmunol，2002，129（1-2）:1-9.

A comparison study of three neurological assessments in the animal model of multiple sclerosis.

MA Ke，CHEN Xiong，ZHENG Junjiong，CHEN Jiacheng，F(xiàn)ENG Yanqing.Department of Neurology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Sun Yat-Sen University，Guangzhou，510080，China.Tel:020-87755766.

Objective To evaluate the effectiveness of three neurological assessments in experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods Thirty-two female C57BL/6 mice（18-20g）were randomly divided into normal group（n=15）and immune group（n=17）.Immune group were induced subcutaneously in the flank by emulsion consisted of MOG33-35and complete Freund’s adjuvant.Mice were assessed by two investigators for 35 days after immunization in a blinded manner using Kono’s 5-point criterion，Weaver’s 15-point criterion and improved 15-point criterion.Based on H&E staining，we analyzed the accuracy，sensibility and dependency of three assessments.Results 35-day clinical-score plots revealed that the fluctuation of symptoms was more obvious in improved 15-point criterion compared with the other two criteria.15-point criterion and improved 15-point criterion are more accurate than 5-point criterion in atypical-onset EAE.15-point criterion and improved 15-point criterion could detect the neurological deficits much earlier than 5-point criterion（P＜0.001）.Neurological scores assessed by improved 15-point were well correlated with the pathological findings during the peak and remission stage.Conclusion Improved 15-point criterion is better neurological score system than Kono’s 5-point criterion and Weaver’s 15-point criterion because of its accurate assessment of the neurological deficits in experimental autoimmune encephalomyelitis.

Multiple sclerosis Experimental autoimmune encephalomyelitisClinical assessment criterion

R744.51

A

2014-11-07）

（責任編輯:李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.11.008

*中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州510080）