金妙妙　傅健飛

（浙江省金華市中心醫(yī)院，浙江金華321000）

·研究報(bào)告·

健脾補(bǔ)腎方對BALBc鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移VEGF表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究*

金妙妙傅健飛

（浙江省金華市中心醫(yī)院，浙江金華321000）

目的探討健脾補(bǔ)腎方對BALBc鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)影響性。方法先對BALBc鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移進(jìn)行模型，隨機(jī)分成環(huán)磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補(bǔ)腎方組，各組均進(jìn)行各自藥物灌胃處理，每日1次，共2周，檢測每組VEGF表達(dá)情況。結(jié)果抑瘤率上，生理鹽水組為0，環(huán)磷酰胺組為35.40%，健脾補(bǔ)腎方組為29.90%，3組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；脾臟指數(shù)上，生理鹽水組為（8.97±0.31）mg/g，環(huán)磷酰胺組為（8.22±0.14）mg/g，健脾補(bǔ)腎方組為（9.11±0.13）mg/g，生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺組和健脾補(bǔ)腎方組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；VEGF表達(dá)率上，生理鹽水組“-”“+”“++”分別占8.33%、8.33%、83.33%，環(huán)磷酰胺組分別占41.67%、25.00%、33.33%，健脾補(bǔ)腎方組分別占33.33%、25.00%、41.67%，環(huán)磷酰胺組和健脾補(bǔ)腎方組VEGF表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補(bǔ)腎組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論健脾補(bǔ)腎方能通過降低BALBc鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移VEGF表達(dá)提高臨床效果。

健脾補(bǔ)腎方BALBc鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮生長因子

結(jié)直腸癌是臨床上常見惡性腫瘤，其中肝轉(zhuǎn)移是造成死亡的最常見原因。研究［1］稱，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移特異性指標(biāo)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大腸癌肝轉(zhuǎn)移是本虛標(biāo)實(shí)證，素體正氣不足，加上飲食不潔、脾腎虧虛、內(nèi)生痰濕，滯留腸道氣機(jī)受阻，運(yùn)行不暢阻于脈絡(luò)后形成大腸癌，隨著病情日漸惡化，濕毒瘀滯造成正氣日漸虧虛，在臨床上常見是脾腎兩虛證，其中正虛表現(xiàn)為脾虛和腎虛，邪實(shí)是熱毒、瘀血和濕熱等外在原因造成，故其主要原因是脾腎虧虛。本次研究就觀察健脾補(bǔ)腎方對BALBc鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移VEGF表達(dá)影響性，以期尋找其中相關(guān)性，提高臨床診治水平?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1動物與細(xì)胞隨機(jī)選取36只BALBc小鼠為研究對象，分成3組，每組12只，均為雄性，平均體質(zhì)量（50.00±10.00）g，均購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證編號為20130112C。選用細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26細(xì)胞，保證選用細(xì)胞為50代以內(nèi)對數(shù)生長期CT26細(xì)胞。

1.2試劑與儀器健脾補(bǔ)腎方，藥物組成為黃芪30 g，白術(shù)15 g，熟地黃15 g，補(bǔ)骨脂10 g，蛇六谷15 g，神曲20 g，甘草6 g等，均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，雙蒸水震蕩混勻，使用超聲促使藥物混合均勻，每毫升藥液含0.2185 g生藥，-20℃冰箱內(nèi)保存。環(huán)磷酰胺（國藥準(zhǔn)字H22022988，通化茂祥制藥有限公司）200 mg混合0.9%氯化鈉注射液20 mL備用。VEGF抗體購自美國西門子公司，凝膠制備試劑盒、蛋白抽取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒等均購自天云生物技術(shù)有限公司。高精確電子天平、臺式高速冷凍離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋等均購自南京天科生物科技有限公司提供。

1.3分組與造模隨機(jī)將小鼠分成環(huán)磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補(bǔ)腎方組，每組12只。取已禁食12 h的小鼠麻醉后在背側(cè)中部、左側(cè)腋中線和腋后線間，取1.5 cm切口進(jìn)入腹腔內(nèi)，暴露脾臟，按0.2 mL/只注入對數(shù)生長期大腸癌CT26細(xì)胞懸液，按壓無出血后將脾臟置于原位，縫合腹壁，直至出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。

1.4給藥方法造模后對每組予相應(yīng)藥物治療，生理鹽水組予0.9%氯化鈉注射液0.4 mL；環(huán)磷酰胺組予環(huán)磷酰胺20 mg/kg；健脾補(bǔ)腎方組予健脾補(bǔ)腎方0.2 mL。各組均每日灌胃治療1次，持續(xù)兩周。

1.5標(biāo)本采集及檢測1）給藥2周后停藥1 d，處死小鼠，剝離瘤塊標(biāo)本，用0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，用濾紙吸干表面水分，稱瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=1-（試驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/生理鹽水組瘤質(zhì)量）。2）分離脾臟后用電子天平秤質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)，指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。用免疫組化法檢測腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)情況。3）分離腫瘤組織，用甲醛固定1 d，取腫瘤組織切成小塊流水沖洗30 min，經(jīng)脫水-透明-浸蠟-包埋制成腫瘤組織石蠟標(biāo)本。將石蠟用且片機(jī)切片，厚度為4 μm，切片經(jīng)3次PBS清洗后滴加三抗，DAB顯色，復(fù)染、透明后封片。VEGF陽性表達(dá)采用SP免疫組化染色進(jìn)行檢測，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性表達(dá)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［2］進(jìn)行計(jì)分。計(jì)分由兩部分組成，一部分為細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分，不顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按顯色細(xì)胞比例計(jì)分，1/3以下為1分，1/3～2/3為2分，2/3以上為3分。積分?jǐn)?shù)為以上兩部分乘積，陰性為乘積0分（“-”表示），弱陽性為乘積1～4分、低表達(dá)（“+”表示），兩者乘積在4分以上為強(qiáng)陽性，高表達(dá)（“++”表示）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，并對數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組抑瘤率指標(biāo)比較見表1。各組抑瘤率比較，生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補(bǔ)腎方組、環(huán)磷酰胺組和健脾補(bǔ)腎方組在抑瘤率上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1　各組瘤質(zhì)量、抑瘤率、脾臟指數(shù)比較

2.2各組脾臟指數(shù)比較各組比較，生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺組和健脾補(bǔ)腎方組在脾臟指數(shù)上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而生理鹽水組和健脾補(bǔ)腎方組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3各組VEGF表達(dá)比較見表2。結(jié)果為生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補(bǔ)腎方組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而環(huán)磷酰胺組和健脾補(bǔ)腎方組VEGF表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　各組VEGF表達(dá)比較n（%）

3　討論

雖然中醫(yī)學(xué)無大腸癌肝轉(zhuǎn)移確切病名，但古籍有記載“臟毒者，蘊(yùn)毒流注肛門結(jié)成腫塊，有虛勞久嗽，痰火結(jié)腫，肛門如栗者，破必成漏，瀝盡氣血必亡”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為瘀毒內(nèi)結(jié)、脾氣虧虛、氣滯血瘀是腫瘤轉(zhuǎn)移的基本病機(jī)。研究［3］稱，健脾補(bǔ)腎能提高機(jī)體免疫力，能抑制腫瘤生長和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，對腫瘤血管生成有明顯抑制作用。

在本次研究中，以黃芪和補(bǔ)骨脂為君藥，黃芪有行氣健脾功效，補(bǔ)骨脂有溫補(bǔ)脾腎效果，兩者共用能達(dá)到VEGF是目前為止發(fā)現(xiàn)的可溶性最強(qiáng)，特異性最高的微血管生長正向調(diào)節(jié)因子，其能改善細(xì)胞外基質(zhì)，增加微血管通透性，降解并轉(zhuǎn)化膠原結(jié)締組織，為腫瘤生成、侵襲和轉(zhuǎn)移提供適合基礎(chǔ)［6-7］。本次結(jié)果顯示，健脾補(bǔ)腎方組在VEGF表達(dá)上明顯低于生理鹽水組，這說明健脾補(bǔ)腎方能降低VEGF表達(dá)從而降低大腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移。研究［8］稱，VEGF和腸癌分化程度、浸潤程度、轉(zhuǎn)移情況等均有相關(guān)性，分化程度越低、浸潤轉(zhuǎn)移越遠(yuǎn)，其表達(dá)也相對越高。有研究［9］指出，黃芪皂苷能下調(diào)VEGF水平從而達(dá)到和環(huán)磷酰胺同樣的抗腫瘤效果，這在本次研究中有所體現(xiàn)，這說明了健脾補(bǔ)腎方能通過下調(diào)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的VEGF因子表達(dá)從而達(dá)到抑制腫瘤生長、浸潤作用。

健脾補(bǔ)腎之能；白術(shù)是益氣健脾常用藥物，熟地黃可滋補(bǔ)腎陰，填精益髓；蛇六谷能散結(jié)消腫、燥濕化痰，神曲則消食，配合甘草調(diào)和諸藥，共達(dá)到補(bǔ)脾氣、填腎精、消結(jié)節(jié)等功效，能提高患者生存質(zhì)量，減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，補(bǔ)骨脂能抑制癌細(xì)胞糖代謝，核酸代謝和能量代謝等，從而達(dá)到抗腫瘤效果；白術(shù)能促使淋巴細(xì)胞壽命延長，起到免疫調(diào)節(jié)作用，白術(shù)多糖能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能和抗腫瘤作用；熟地黃能降低膜磷脂代謝并改善脂肪酸組成，影響細(xì)胞表面特性并轉(zhuǎn)運(yùn)膜代謝，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生抗腫瘤作用［5］；黃芪對人體有雙向調(diào)節(jié)作用，蛇六谷能通過影響癌細(xì)胞能量代謝從而抑制腫瘤生長。結(jié)果看出，應(yīng)用健脾補(bǔ)腎方治療后，患者在脾臟指數(shù)和抑瘤率上明顯得到改善，這說明了中醫(yī)藥對大腸癌肝轉(zhuǎn)移有很好療效。

伴隨著惡性腫瘤在臨床上發(fā)病率越來越高，中醫(yī)藥治療已經(jīng)成為綜合治療很大一部分，中醫(yī)藥能提高患者對化療等耐藥性，改善生活質(zhì)量，緩解不良反應(yīng)，能減少手術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［10］，在一定程度上能延長患者生存時間，故有很大的實(shí)際臨床意義。

［1］周麗萍，馬科，馬治國，等.健脾補(bǔ)腎方對小鼠Lewis肺癌抑制作用及對VEGF、CD44V6表達(dá)的影響［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（4）：319-322.

［2］王希勝，肖紅艮.健脾補(bǔ)腎方對Lewis肺癌移植瘤小鼠EGFR和VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究［C］.2013年全國中醫(yī)腫瘤學(xué)術(shù)年會論文集，2013：395-398.

［3］周麗萍.健脾補(bǔ)腎方對小鼠Lewis肺癌生長抑制作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［D］.銀川：寧夏醫(yī)科大學(xué)，2012.

［4］肖紅根.健脾補(bǔ)腎方對Lewis肺癌移植瘤小鼠EGFR和VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究［D］.咸陽：陜西中醫(yī)學(xué)院，2013.

［5］高軍，高國蘭，余筱琳，等.P53和VEGF在SKOV3荷瘤裸鼠不良心理應(yīng)激模型血清及移植瘤中的表達(dá)及意義［J］.天津醫(yī)藥，2012，38（12）：1072-1075.

［6］秦躍紅，王功朝，劉濱，等.星形細(xì)胞腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C的表達(dá)變化及其與腫瘤血管生成的關(guān)系［J］.山東醫(yī)藥，2014，2（15）：1-3.

［7］宋冀東，閆繼東.Smad4和VEGF在人非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性分析［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014，5（11）：1781-1784.

［8］馬科，吳學(xué)勤，周麗萍，等.健脾補(bǔ)腎方對Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞抑制作用及對Ki-67表達(dá)影響的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（9）：2176-2177.

［9］董妙.健脾補(bǔ)腎方對Lewis肺癌移植瘤小鼠COX-2和PTTG表達(dá)的影響［D］.咸陽：陜西中醫(yī)學(xué)院，2014.

［10］張正，嚴(yán)燦，李艷，等.反復(fù)心理應(yīng)激大鼠下丘腦及腦海馬氨基酸含量變化及調(diào)肝方、健脾方、補(bǔ)腎方、人參總皂苷作用的比較［J］.中國臨床康復(fù)，2012，9（48）：179-181.

Experimental Study of Jianpi Bushen Decoction on the Expression of VEGF in BALBc Rat with Liver Metastasis of Colorectal Cancer

Metastasis of Colorectal Cancer
JIN Miaomiao，F(xiàn)U Jianfei.Central Hospital of Jinhua City，Zhejiang Province，Zhejiang，Jinhua 321000，China

Objective：To investigate the effects of Jianpi Bushen Decoction on the expression of VEGF in BALBc rat with liver metastasis of colorectal cancer.Methods：At first，BALBc mouse model was made with liver metastasis of colorectal cancer，and randomly divided into the cyclophosphamide group，the saline group and Jianpi Bushen Decoction groups.Each group was treated with drug perfusion once per day，lasting for 2 weeks，and the expression of VEGF was detected.Results：As for the inhibition rate，the saline group was 0，the cyclophosphamide group 35.4%，Jianpi Bushen Decoction group 29.9%，with statistical significance（P＜0.05）；as for the spleen index，the saline group was（8.97±0.31）mg/g，the cyclophosphamide group（8.22±0.14）mg/g，Jianpi Bushen Decoction group（9.11±0.13）mg/g；there was statistical significance between the saline group and the cyclophosphamide group，and between the cyclophosphamide group and Jianpi Bushen Decoction group（P＜0.05）. As for the expression of VEGF，-，+，+of the saline group was respectively 8.33%，8.33%and 83.33%，the cyclophosphamide group 41.67%%，25.00%and 33.33%，Jianpi Bushen Decoction group 33.33%，25%，41.67%. The difference in the cyclophosphamide group and Jianpi Bushen Decoction group in VEGF expression was not statistically significant（P＞0.05），while the difference between the two groups was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：spleen and kidney in order by reducing BALBc mouse VEGF expression in colorectal liver metastases improve clinical results.

Jianpi Bushen Decoction；BALBc mouse；Liver metastasis of colorectal cancer；Vascular endothelial growth factor

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1906-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.008

2015-05-01）

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浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY13H190006）