馮艷琴　姚忠紅　秦雪琴　穆敬平　陳德森

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰442000）

·研究報告·

穴位注射骨瓜提取物注射液聯(lián)合電針夾脊穴對兔骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折二聚糖的影響*

馮艷琴1姚忠紅1秦雪琴1穆敬平1陳德森2△

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰442000）

目的觀察穴位注射骨瓜提取物注射液聯(lián)合電針夾脊穴對骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折動物模型二聚糖及血清基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的影響。方法雌性新西蘭兔40只，隨機分為模型組、穴位注射組、電針組、聯(lián)合治療組，采用去勢法手術(shù)切除新西蘭兔卵巢，用混有糖皮質(zhì)激素的飼料飼養(yǎng)4個月后造成動物骨質(zhì)疏松，再采用手術(shù)方法造成骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折動物模型，造模成功后電針組電針夾脊穴30 min；穴位注射組選夾脊穴多點穴位注射骨瓜提取物注射液；聯(lián)合治療組電針夾脊穴30 min后穴位注射骨瓜提取物注射液。采用酶免疫吸附試驗測定血清基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs：MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10）陽性表達率，采用免疫熒光法測定腰椎間盤組織二聚糖中的表達。結(jié)果經(jīng)21 d治療，聯(lián)合治療組腰椎間盤組織二聚糖表達明顯增高，血清MMP-1、MMP-3、MMP-9明顯降低，與穴位注射組及電針組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論穴位注射骨瓜提取物注射液聯(lián)合電針夾脊穴治療兔骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折的作用機制可能為電針夾脊穴可激發(fā)經(jīng)氣、活經(jīng)通絡(luò)、提高二聚糖黏附椎間盤細胞數(shù)量、調(diào)節(jié)椎間盤成骨細胞及破骨細胞的動態(tài)平衡，骨瓜提取物注射液穴位注射吸收后降低MMP-1、MMP-3、MMP-9對腰椎間盤基質(zhì)的降解，抑制椎間盤組織退行性變，調(diào)節(jié)退變椎間盤細胞的代謝平衡，促進骨折愈合的作用。

骨瓜提取物注射液穴位注射電針夾脊穴骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折二聚糖基質(zhì)金屬蛋白酶

骨瓜提取物注射液是用新鮮或冷凍的豬四肢骨和葫蘆科植物甜瓜（Cucumis melo L.）的干燥成熟種子提取物制成的［1］，富含多種游離氨基酸、甜瓜籽提取物、多肽類骨代謝因子、無機鹽及微量元素等［2］，具有調(diào)節(jié)骨代謝，刺激成骨細胞增殖，促進新骨形成以及調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，可增加骨鈣沉積而防治骨質(zhì)疏松，同時還具有鎮(zhèn)痛抗炎作用［3］。骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折以腰椎L1～L5多見，由于關(guān)節(jié)軟骨細胞的分解與合成代謝紊亂，其病理改變以骨質(zhì)疏松、腰椎間盤突（脫）出、關(guān)節(jié)面軟骨破壞、變性并繼發(fā)滑液炎而造成的退行性關(guān)節(jié)疾?。?］。臨床以腰椎疼痛、變形、活動受限為主要特點，目前治療辦法多以針灸抗炎消腫為主，但療效不理想。本實驗通過穴位注射骨瓜提取物注射液聯(lián)合電針夾脊穴來觀察其對骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折的影響，旨在挖掘中醫(yī)藥治療關(guān)節(jié)炎優(yōu)勢，探討其作用機制，為臨床提供安全可靠的治療方案。

1　材料與方法

1.1實驗動物新西蘭兔40只，雌性，體質(zhì)量（2500± 50）g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物中心提供，合格證號：SCXK（鄂）2011-0008。

1.2試劑與儀器骨瓜提取物注射液（哈爾濱圣泰生物制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H23023507）；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）測試盒（上海森雄科技實業(yè)有限公司）；SDZ-Ⅱ型電子針療儀（上海坤弘，型號：SDZ-Ⅱ）。

1.3分組與造模采用隨機數(shù)字表編號，隨機將實驗動物分為模型組、穴位注射組、電針組、聯(lián)合治療組，每組10只。骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折動物模型的制備參照文獻［5］：腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，仰臥位腹部向上固定于兔手術(shù)臺，用紗布蘸取80 g/L的硫化鈉剃掉兔手術(shù)區(qū)毛發(fā)，碘伏消毒，手術(shù)切除雌兔雙側(cè)卵巢，用混有糖皮質(zhì)激素的飼料飼養(yǎng)3個月后造成動物骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松形成后，參照文獻［6］，采用手術(shù)方法造成骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折動物模型，手術(shù)方法：動物麻醉同上，右側(cè)臥位固定于兔手術(shù)臺，手術(shù)部位鋪無菌單，碘伏消毒后于脊柱旁椎體L1～L5水平處縱行切開皮膚，皮下組織、深筋膜，暴露腹膜后間隙。鈍性分離椎前肌肉及韌帶，在靠近椎間盤處用鋼絲剪從椎體側(cè)前方剪斷椎體前緣，剪斷后不做內(nèi)固定，分層縫合深筋膜、皮下組織，關(guān)閉綜合皮膚，再次消毒處理。術(shù)后注意預(yù)防感染，可肌肉注射慶大霉素4萬U（8萬U/支，每日1次，注射7 d），本實驗?zāi)Ｐ统晒β蕿?00%。

1.4治療方法在椎體壓縮骨折術(shù)后1個月待傷口愈合后，各組分別將兔固定后行相應(yīng)治療。1）電針組參照《實驗針灸學(xué)》［7］，電針兔脊柱兩側(cè)夾脊穴，針刺入（深約0.5～0.8 mm），行導(dǎo)氣手法，旁開2～3 cm配穴，以夾脊穴齊刺點為正極，配穴為負極，接SDZ-Ⅱ型電子針療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，留針30 min，每日1次，連續(xù)21 d。2）穴位注射組選夾脊穴多點注射骨瓜提取物注射液1 mg/（d·kg），每日1次，連續(xù)21 d。3）聯(lián)合治療組先電針夾脊穴30 min，后穴位注射骨瓜提取物注射液1 mg/（d·kg），每日1次，連續(xù)21 d。4）模型組僅固定，不做任何治療。

1.5觀察指標(biāo)參照文獻［8］，于治療前后分別采用免疫熒光法測定腰椎間盤組織二聚糖中的表達；抽取耳緣靜脈血，采用夾心ELISA法測定樣本中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10的OD值。檢測方法：1）先將耳緣靜脈血樣本用包被緩沖液稀釋包被，加入聚苯乙烯酶標(biāo)板中4℃過夜，去掉包被液，酶標(biāo)板中每孔中加入200 μL封閉液，37℃恒溫靜置2 h后用PBS洗滌液沖洗2次并甩干；2）每孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液振動混勻并37℃靜置2 h，再用PBS洗滌3次。3）酶標(biāo)板中每孔加入100 μL辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體，37℃靜置2 h后用PBS洗滌液沖洗3次。4）酶標(biāo)板中每孔加入DAB底物液100 μL，37℃避光反應(yīng)10 min，每孔中加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀測定OD值。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，組間差異采用Dunnett檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組椎間盤組織二聚糖光密度比較見表1。模型組未采取任何治療措施，故椎間盤二聚糖光密度保持在較低水平；電針組、聯(lián)合治療組椎間盤二聚糖光密度升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；穴位注射組椎間盤二聚糖光密度升高不明顯，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；聯(lián)合治療組椎間盤二聚糖光密度明顯升高，與穴位注射組及電針組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。

2.2各組治療后兔MMPs水平比較見表2。模型組未采取任何治療措施，故MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10陽性表達率治療后無明顯變化；穴位注射組、電針組、聯(lián)合治療組MMP-1、MMP-3、MMP-9有一定的降低趨勢，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），但MMP-2、MMP-10無明顯變化，穴位注射組與電針組組間比較無顯著差異（P＞0．05）。聯(lián)合治療組MMP-1、MMP-3、MMP-9顯著降低，與穴位注射組及電針組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），MMP-2、MMP-10有一定的降低趨勢，與穴位注射組及電針組比較無顯著差異（P＞0．05）。

表1　各組治療前后椎間盤組織二聚糖光密度比較（±s）

表1　各組治療前后椎間盤組織二聚糖光密度比較（±s）

與模型組比較，△P＜0.05；與穴位注射組比較，▲P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05。下同。

組別n治療前治療后聯(lián)合治療組100.073±0.0090.172±0.019△▲#模型組100.072±0.0080.074±0.011穴位注射組100.075±0.0100.079±0.010電針組100.077±0.0110.124±0.016△▲

表2　各組治療21 d后兔MMPs比較（ng/L，±s）

表2　各組治療21 d后兔MMPs比較（ng/L，±s）

組別n聯(lián)合治療組10模型組10穴位注射組10電針組10 MMP-1MMP-2MMP-3 1.89±0.15△▲#2.70±0.22 0.41±0.05▲#4.97±0.342.89±0.20 0.97±0.10 2.45±0.21△2.77±0.27 0.68±0.08△2.52±0.24△2.81±0.23 0.62±0.06△MMP-9MMP-10 1.96±0.15△▲#6.29±0.47 3.12±0.206.57±0.54 2.74±0.17△6.39±0.51 2.65±0.16△6.47±0.49

3　討論

骨質(zhì)疏松椎體壓縮骨折由于機體脫鈣后造成骨結(jié)構(gòu)異常，多發(fā)于器官處于衰退期老年人，尤以絕經(jīng)后女性為甚［9］。骨質(zhì)疏松分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種類型［10］。骨質(zhì)疏松患者破骨細胞數(shù)量增多，成骨細胞活動減弱，骨基質(zhì)、骨鈣均減少，新骨的形成遠少于骨的吸收而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松［11］。骨質(zhì)疏松后骨強度降低、骨強度的降低時，椎體骨在遭受輕微外力作用時都可能發(fā)生骨折，不僅會影響脊柱功能，還將導(dǎo)致呼吸、消化等多系統(tǒng)的功能障礙，對患者的日常生活造成嚴(yán)重影響［12］。骨質(zhì)疏松椎體壓縮骨折病因主要椎體骨質(zhì)破壞與變性，是骨的分解與合成代謝失衡的結(jié)果［13］。

血清MMPs有二十多種亞型，如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10等，其中MMP-1、MMP-3、MMP-9在降解關(guān)節(jié)基質(zhì)起到至關(guān)重要的作用［14］。椎體終板損傷可引起椎間盤退變，椎間盤組織細胞成分改變，蛋白多糖、水分減少導(dǎo)致二聚糖陽性表達下調(diào)和椎間盤退變的發(fā)生。二聚糖能黏附椎間盤細胞，并激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白通路。二聚糖既可抑制表皮生長因子和成骨蛋白-1對椎間盤組織的合成代謝，又可抑制白細胞介素（IL）-1對椎間盤組織分解代謝的影響，從而調(diào)節(jié)正常椎間盤細胞和退變椎間盤細胞的代謝平衡，間接參與抑制椎間盤組織退變［15］。骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折患者椎間盤組織中二聚糖異常降低，血清MMPs陽性表達增多。

實驗中選用新西蘭兔以夾脊穴齊刺點為正極，配穴為負極，配合穴位注射骨瓜提取物注射液注射液。結(jié)果顯示，經(jīng)21 d治療，聯(lián)合治療組腰椎間盤組織二聚糖表達明顯增高，MMP-1、MMP-3、MMP-9明顯降低。椎間盤退行性變的主要病理基礎(chǔ)是骨質(zhì)疏松，而骨質(zhì)疏松是椎體壓縮骨折誘因，構(gòu)成椎間盤退行性變的主要因素有Ⅰ型膠原、硫酸角質(zhì)素與硫酸軟骨素的比例增多，Ⅱ型膠原、水分、蛋白多糖含量減少，增加等。這些因素均影響椎間盤生物力學(xué)。椎間盤退行性變時二聚糖等基因表達下調(diào)，二聚糖由2個糖胺多糖鏈黏附區(qū)和1個約45 kD的核心蛋白組成，存在于椎間盤間質(zhì)細胞表面及其周圍。二聚糖能黏結(jié)一些基質(zhì)分子，與細胞外基質(zhì)緊密聯(lián)系，對退變椎間盤組織的自我修復(fù)具有重要作用。可抑制表皮生長因子椎間盤組織合成代謝及抑制白細胞介素-1對椎間盤組織分解代謝，從而調(diào)節(jié)正常椎間盤細胞和退變椎間盤細胞的代謝平衡，間接參與抑制椎間盤組織退變［16］。本實驗造模后經(jīng)兔自身重力作用誘導(dǎo)椎間盤發(fā)生退變并手術(shù)造成椎體壓縮骨折，模型組時熒光強度降低，說明二聚糖陽性表達下調(diào)，椎間盤退變加劇。在電針夾脊穴治療21 d后，熒光強度增高，提示二聚糖陽性表達上調(diào)。分析認為，電針刺激兔脊柱兩側(cè)夾脊穴時，SDZ-Ⅱ型電子針療儀可輸出低、中頻電流，由于其電流的陰抗性較小，易通過人體，作用較深。同時夾脊穴可在局部形成較高的電位差，可激發(fā)經(jīng)氣，緩解腰椎間盤血管痙攣，促進局部小血管擴張、改善血液循環(huán)，促進骨質(zhì)疏松椎體壓縮骨折局部病變組織二聚糖的新陳代謝，降低痛閾、減輕腰椎間盤突（脫）出表面神經(jīng)神經(jīng)末梢對炎性因子IL-1β、前列腺素2（PGE2）等的刺激反應(yīng)敏感度。由于骨瓜提取物注射液中富含多種游離氨基酸，為成骨細胞合成BMPs，TGF-β等骨源性生物因子提供能量和原料，促進骨源性生物因子的合成。實驗證實骨瓜提取物注射液中的多肽類骨代謝因子增加BMPs的合成，抑制MMP-1過度表達［17］。聯(lián)合治療組兔在穴位注射骨瓜提取物注射液后，MMP-1、MMP-3、MMP-9顯著降低，較單用電針刺激及穴位注射降低明顯，這可能是穴位注射骨瓜提取物注射液吸收后抑制機體產(chǎn)生過多的IL-lB及PGE2等炎癥因子，降低滑膜的通透性及因炎癥刺激而造成MMP-1、MMP-3、MMP-9細胞陽性表達，減輕對椎間盤基質(zhì)降解、促進鈣、磷代謝，增加骨鈣沉積［18］，防治和改善骨質(zhì)疏松、延緩軟骨退變及保護關(guān)節(jié)軟骨、促進椎體壓縮骨折愈合的作用。

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Effect of Acupoint Injection of Bone Extract Combined with Electro Acupuncture on the Biglycan of the Osteoporotic Vertebral Compression Fractures

FENG Yanqin，YAO Zhonghong，QIN Xueqin，et al.Taihe Hospital of Shiyan，City，Hubei Province，Hubei，Shiyan 442000，China

Objective：To establish an animal model of osteoporotic vertebral compression fractures in New Zealand rabbits，and observe the effect of acupoint injection combined with electro acupuncture and electro acupuncture on the treatment of these diseases，and provide a theoretical basis for the clinical treatment of this disease.Methods：40 female New Zealand rabbits were randomly divided into the model group，the acupoint injection group，the electroacupuncture group，the combined treatment group，with castration method to remove the ovary of New Zealand rabbit，fed with mixed sugar cortical hormone feed for 4 months，causing osteoporosis.After making a successful model，the EA group received EA clip ridge point for 20 minutes；the acupoint injection group selected Jiaji point acupoint injection of bone melon extract injection；the combined treatment of electroacupuncture group received Jiaji acupoint injection and 30minutes later the bone melon extract injection.The positive expression rate of serum matrix metalloproteinases（MMPs metallopro-teinases，MMPs：MMPsMMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，and MMP-10）were detected with Enzyme immunoassay method，and the expression of biglycan in lumbar intervertebral disc tissue was tested with immune fluorescence method.Results：After 21 days′treatment，compared with the acupoint injection group and the electroacupuncture group，the expression of biglycan in lumbar intervertebral disc tissue of the combined treatment group increased significantly with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：The mechanism of the treatment may be that EA Jiaji points can arouse the Qi，Tongluo，increase the number of biglycan adhesion of intervertebral disc cells，regulate the dynamic balance of the intervertebral disc cells and osteoclasts and that bone melon extract injection in acupoint injection ofabsorption decreases MMP-1，MMP-3，MMP-9 on lumbar intervertebral disc matrix degradation，inhibit intervertebral disc degenerative changes and regulate metabolic balance of degenerated intervertebral disc cells and promote fracture healing.

Bone extract injection；Point injection；Electroacupuncture at the point of the lumbar spine；Osteoporosis vertebral compression fracture model；Biglycan

R245.9+5

A

1004-745X（2015）11-1911-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.010

2015-07-01）

湖北省科技廳科技項目（2013cfc037）

（電子郵箱：cdscds1226@126.com）