林凱旋　安輝　繆燦銘　黃國強　刁建新

（1.廣州中醫(yī)藥大學中山附屬醫(yī)院，廣東中山528400；2.南方醫(yī)科大學動物實驗中心，廣東廣州510000）

益氣化瘀方對缺血-再灌注大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響*

林凱旋1安輝1繆燦銘1黃國強1刁建新2

（1.廣州中醫(yī)藥大學中山附屬醫(yī)院，廣東中山528400；2.南方醫(yī)科大學動物實驗中心，廣東廣州510000）

目的觀察益氣化瘀方對缺血-再灌注（I/R）大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas及P53表達的影響。方法采用結扎左冠狀動脈前降支，心肌缺血30 min，再灌注2、4 h制作缺血-再灌注模型。將大鼠隨機分為7組，即假手術組、模型2 h組（缺血-再灌注2 h）、模型4 h組（缺血-再灌注4 h組）、通心絡2 h組（缺血-再灌注2 h）、通心絡4 h組（缺血-再灌注4 h）、益氣化瘀方2 h組（缺血-再灌注2 h）、益氣化瘀方4 h組（缺血-再灌注4 h）。造模前連續(xù)灌胃相應藥物1周。免疫組化法測定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表達。結果益氣化瘀方可提高缺血-再灌注大鼠心肌Bcl-2蛋白表達量（P＜0.05）、降低缺血-再灌注大鼠心肌Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表達量（P＜0.05）。結論益氣化瘀方可減輕大鼠心肌缺血-再灌注細胞凋亡，其機理可能與上調Bcl-2蛋白表達和下調Bax、Caspase-3、fas、P53蛋白表達有關。

缺血-再灌注損傷心肌細胞凋亡益氣化瘀方Bcl-2蛋白Bax蛋白Caspase-3蛋白fas蛋白P53蛋白

近年來，細胞凋亡的研究改變了人們對許多心血管疾病的認識。既往認為心肌缺血、缺血/再灌損傷造成的心肌細胞死亡形式是細胞壞死。近年研究證明［1］，氧化應激、負荷過重、缺血、缺氧、再灌注損傷等不僅引起心肌細胞壞死，還可誘導心肌細胞凋亡。細胞凋亡是受一系列程序控制并通過信號通路介導的病理過程，阻斷其信號通路將有助于阻斷凋亡發(fā)生，防止心肌細胞數(shù)目的減少，維持或改善心功能［2］。筆者通過多年的臨床觀察發(fā)現(xiàn)：益氣化瘀方能減少急性心肌梗死冠狀動脈介入手術（PCI）后再灌注損傷。為明確其機理，本研究應用大鼠實驗性心肌缺血再灌注模型，采用免疫組化法對心肌凋亡相應調控蛋白進行觀察，為防治心肌缺血/再灌損傷從而促進心肌細胞功能恢復提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物健康雄性SD大鼠（鼠齡3個月左右）42只，體質量（220±20）g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SXCK粵2011-0015。

1.2試劑與儀器益氣化瘀方：中山市中醫(yī)院制劑室制造，批號：粵20130227。通心絡膠囊：石家莊以嶺藥業(yè)，批號：120404。細胞凋亡原位檢測試劑盒（POD）購自Roche公司，SP試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3分組與給藥將42只SD大鼠隨機分為7組：假手術組、模型2 h組（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、模型4 h組（30 min心肌缺血后再灌注4 h）、通心絡2 h組（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、通心絡4 h組（30 min心肌缺血后再灌注4 h）、益氣化瘀方2 h組（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、益氣化瘀方4 h組（30 min心肌缺血后再灌注4 h），每組6只。各組大鼠于造模前1周開始灌胃給藥，連續(xù)7 d。益氣化瘀方組予益氣化瘀方1.8 mL［生藥含量7.2 g/（kg·d）］，通心絡組予通心絡藥粉兌入0.9%氯化鈉注射液溶液1.8 mL［生藥含量0.142 g/（kg·d）］，其余3組予等量0.9%氯化鈉注射液。

1.4模型制備10%烏拉坦腹腔注射麻醉（1 mL/100 g）大鼠，仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標準肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖。于胸骨左緣3～4肋間切開胸壁，暴露心臟，在左心耳與肺動脈于之間結扎左冠狀動脈前降支，同時在結扎線與血管之間穿一直徑2 mm，長5 mm的硅膠管，結扎30 min；然后剪斷縫合線，取出硅膠管，各組分別再灌注2 h或再灌注4 h，以往已有實驗證實此缺血再灌注時間足以引起心肌細胞凋亡。假手術組僅分離前降支，但不結扎。

1.5標本采集及檢測1）心肌細胞凋亡率檢測。石蠟包埋心肌組織，采用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT酶）介導的帶熒光的dUTP缺口末端標記法（TUNEL）檢測。結果根據(jù)凋亡陽性細胞分布情況，每張切片拍攝10個陽性視野，每視野記數(shù)30個心肌細胞中陽性細胞數(shù)，以平均計算陽性細胞所占的百分比作為細胞凋亡率（AR）。2）Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表達檢測。取上述石蠟標本相應部位的連續(xù)切片各5張，采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（SP）法進行免疫組化染色和DAB顯色法。每張切片于陽性表達區(qū)域選擇10個無重疊視野，用圖像分析儀進行分析，并計算其光密度值的均值。

1.6統(tǒng)計學處理應用SPSS13統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，使用方差分析方法計算平均值，并且進行多重分析。如果方差齊，平均值是通過方差分析，個體差異有意義，再進行多重分析。如果方差不齊，平均值是用Welch的檢驗，他們的個體差異由Games-Howell的分析。多組比較采用方差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組心肌細胞凋亡情況比較見表1。經(jīng)TUNEL染色及蘇木精復染后凋亡細胞核呈棕色，正常細胞核染藍色。假手術組缺血-再灌注2 h后僅見極少數(shù)散在的凋亡細胞，模型組凋亡細胞數(shù)與假手術組相比明顯增加（P＜0.05），隨著再灌注時間延長細胞凋亡數(shù)顯著增加（P＜0.05）。益氣化瘀方組及通心絡組凋亡細胞數(shù)較相同灌注時間的模型組顯著下降（P＜0.05）。

表1　各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較（±s）

表1　各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較（±s）

與假手術組比較，△P＜0.05；與模型2 h組比較，*P＜0.05；與模型4 h組比較，#P＜0.05。下同。

組別n劑量［g/（kg·d）］細胞凋亡率（%）假手術組100.081.00±0.40*#模型2 h組100.0826.50±2.80△#模型4 h組100.0840.20±2.90△*通心絡2 h組100.1414.10±1.00△*#通心絡4 h組100.1416.70±2.20△*#益氣化瘀方2 h組107.2012.20±1.90△*#益氣化瘀方4 h組107.2020.30±5.36△#

2.2各組心肌細胞Bcl-2表達的比較見表2。假手術組見較多的Bcl-2蛋白陽性染色胞質。模型組2 h及4 h的Bcl-2蛋白表達顯著減少（P＜0.05），通心絡組和益氣化瘀方組2 h及4 h后Bcl-2蛋白表達較模型組顯著增加（P＜0.05）。

表2　各組大鼠心肌細胞Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達比較（光密度值，±s）

表2　各組大鼠心肌細胞Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達比較（光密度值，±s）

組別nBcl-2Bax假手術組100.90±0.07*#1.34±0.09*#模型2 h組100.63±0.05△0.63±0.03△模型4 h組100.75±0.06△0.71±0.04△通心絡2 h組100.81±0.07*#1.34±0.10*#通心絡4 h組100.73±0.050.81±0.02△益氣化瘀方2 h組100.95±0.06*#1.27±0.01*#益氣化瘀方4 h組100.89±0.06*#0.87±0.03△

2.3各組心肌細胞Bax表達的比較見表3。假手術組僅見極少數(shù)散在的Bax蛋白陽性染色胞質。模型組2 h及4 h的Bax蛋白的表達顯著增加（P＜0.05），通心絡組和益氣化瘀方組2 h及4 h后Bax蛋白表達較模型組減少（P＜0.05）。

表3　各組大鼠心肌細胞Caspase-3、Fas、P53蛋白表達比較（光密度值，±s）

表3　各組大鼠心肌細胞Caspase-3、Fas、P53蛋白表達比較（光密度值，±s）

組別nCaspase-3假手術組100.22±0.01*#模型2 h組100.39±0.01△模型4 h組100.48±0.02△通心絡2 h組100.28±0.01*#通心絡4 h組100.39±0.02△*益氣化瘀方2 h組100.36±0.01△益氣化瘀方4 h組100.43±0.02△FasP53 0.28±0.02*#0.32±0.02*#0.65±0.06△0.77±0.03△0.69±0.06△0.83±0.03△0.41±0.02△*#0.51±0.01△*#0.49±0.03△*#0.64±0.03△*#0.45±0.03△*#0.56±0.02△*#0.53±0.04△*#0.54±0.02△*#

2.4各組心肌細胞Caspase-3表達的比較見表3。假手術組僅見極少數(shù)散在的Caspase-3蛋白陽性染色胞質。模型組2 h及4 h的Caspase-3蛋白的表達顯著增加（P＜0.05），通心絡組和益氣化瘀方組2 h及4 h后Caspase-3蛋白表達較模型組減少（P＜0.05）。

2.5各組心肌細胞Fas表達的比較見表3。假手術組僅見極少數(shù)散在的Fas蛋白陽性染色胞質。模型組2 h及4 h的Fas蛋白的表達顯著增加（P＜0.05），通心絡組和益氣化瘀方組2 h及4 h后Fas蛋白表達較模型組減少（P＜0.05）。

2.6各組心肌細胞P53表達的比較見表3。假手術組僅見極少數(shù)散在的P53蛋白陽性染色胞質。模型組2 h及4 h的P53蛋白的表達顯著增加（P＜0.05），通心絡組和益氣化瘀方組2 h及4 h后P53蛋白表達較模型組減少（P＜0.05）。

3　討論

隨著急性心肌梗死再灌注治療的廣泛開展，再灌注損傷的研究也逐漸深入，細胞凋亡是心肌缺血-再灌注損傷的重要機制之一。細胞凋亡是個體發(fā)育過程中由一系列基因控制的細胞主動死亡過程。在多數(shù)細胞類型中，原癌基因Bcl-2蛋白家族與P53是重要的細胞凋亡調節(jié)因子，在細胞凋亡中相互聯(lián)系，相互作用，從而調控細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)［3］，Bcl-2家族蛋白根據(jù)結構功能不同分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。前者主要有Bcl-2，后者主要有Bax，各蛋白之間可形成同源或異源二聚體，構成一個復雜的調控網(wǎng)絡，細胞內Bcl-2與Bax的相對比值可能在決定細胞接受凋亡信號刺激后是否發(fā)生凋亡過程中起關鍵作用。比值增加，可抑制細胞凋亡的發(fā)生，反之，則促進細胞凋亡。同時細胞凋亡發(fā)生是一個復雜的有Caspase家族成員介導的蛋白酶級聯(lián)反應過程，根據(jù)Caspase在凋亡級聯(lián)反應中的作用位置可分為上游調控其他Caspase活化的始動Caspase如Caspase-1、2、4、5、8等以及下游直接介導細胞凋亡實施的效應Caspase如Caspase-3、6、7等［4-6］。其核心成員為Caspase-3，是細胞凋亡早期階段激活的關鍵蛋白酶，在細胞凋亡過程中起中心環(huán)節(jié)作用，故也被稱為死亡蛋白酶，是目前已知的凋亡最后執(zhí)行因子［7-8］。根據(jù)以往的研究，Caspase-3的激活作為判斷細胞凋亡嚴重性的可靠指標之一。若抑制Caspase-3蛋白的激活表達，則可明顯減輕凋亡的產(chǎn)生［9-11］。Fas/ Fas-L系統(tǒng)為主的膜受體死亡通路在細胞凋亡發(fā)生中起重要作用。Fas-L屬于腫瘤壞死因子細胞因子超家族，F(xiàn)as-L與表達Fas的靶細胞交聯(lián)后，啟動凋亡信號轉導途徑，導致Fas表達陽性的靶細胞凋亡。

益氣化瘀方是本院繆燦銘名中醫(yī)多年臨床經(jīng)驗方，由五指毛桃、三七、丹參、仙鶴草、紅景天5味中藥制成，具有補益心氣、活血化瘀的功效。在本科用于預防冠心病支架內再狹窄［12］。經(jīng)過多年的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀方還能減輕急性心肌梗死急診PCI后的再灌注損傷。本次動物實驗證實，該方可以減少大鼠急性心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡，且能減少促進心肌細胞凋亡的相關調節(jié)蛋白Bax、Caspase-3、Fas及P53的表達，增加抑制心肌細胞凋亡的相關調節(jié)蛋白Bcl-2表達，且與通心絡膠囊在抑制缺血再灌注后心肌細胞凋亡方面有相似功效?，F(xiàn)代藥理研究證實，益氣化瘀方中五指毛桃所含補骨脂素具有抗凝、免疫調節(jié)、激素樣作用［8］。三七有效成分三七總皂苷對心肌缺血再灌注損傷有很強的保護作用，對AngⅡ誘導的細胞凋亡具有明顯抑制作用，主要抑制心肌細胞內鈣超載，從而保護心肌細胞［9］。丹參中丹參酮Ⅱ具有抗動脈粥樣硬化、降低心肌耗氧量、縮小心肌梗死面積等多種心血管藥理活性作用［10］；紅景天能使機體整體的耗氧速度速度降低、提高對缺氧的耐力，同時增加血液的載氧能力，增加機體抗病能力。全方合用，可達抗凝、減輕鈣超載、抑制心肌細胞凋亡、縮小心肌梗死面積、改善心肌耗氧等作用，從而減輕缺血再灌注損傷。

因該實驗方法是持續(xù)給藥7 d后進行，與臨床上急性心肌梗死介入治療術前緊急給藥有一定差異，故而有一定局限性，具體結果還需要臨床進一步驗證。

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Effect of Yiqi Huayu Decoction on the Expression of Apoptosis Related Proteins in Myocardial Cells of Rats with Ischemia Reperfusion Injury

LIN Kaixuan，AN Hui，Miao Canming，et al.Zhongshan Affiliated Hospital of Guangzhou TCM University，Guangdong，Zhongshan 528400，China

Objective：To investigate the Yiqi Huayu Decoction on myocardial cell apoptosis and Bcl-2，Bax，Caspase-3，fas and P53 protein expression in experimental rats with myocardial ischemia and reperfusion（ischemia/reperfusion，I/R）and to analyze the pathological damage in myocardial tissue.Methods：The myocardialischemia-reperfusion injury model was established by occluding the left anterior descending branch of coronary artery for 30 minutes and removing the ligation later to reperfusion for 2 hours，4 hours.Forty-two rats were randomly divided into seven groups：the normal（Normal）group，the sham operation（Sham）group，the saline ischemia-reperfusion 2 hours（NS-2 h）group，the saline ischemia-reperfusion 4 hours（NS-4 h）group，Tongxinluo control 2 hours group（TXL-2 h），Tongxinluo control 4 hours group（TXL-4 h），Yiqi Huayu Decoction treatment 2 hours group（YQ-2 h），and Yiqi Huayu Decoction treatment 4 hours group（YQ-4 h）.Bcl-2，Bax Caspase-3，F(xiàn)as and P53 protein expression were tested by immunohistochemical staining method.Results：Yiqi Huayu Decoction increased the Bcl-2 protein expression（P＜0.05）and reduced the Bax，Caspase-3，F(xiàn)as and P53 protein expression（P＜0.05）in rats with myocardial ischemia.Conclusion：The mechanism of Yiqi Huayu Decoction against myocardial apoptosis may be related to the increase of Bcl-2 protein expression and decrease of Bax，Caspase-3，F(xiàn)as and P53 protein expression.

Myocardialischemia-reperfusion injury；Myocardial apoptosis；Yiqi Huayu Decoction；Bcl-2 protein；Bax protein；Caspase-3 protein；Fas protein；P53 protein

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1936-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.017

2015-07-05）

·綜述·

廣東省中山市科技局科技計劃立項重大項目（20113A003）