鄭易之, 范文靜, 劉　科, 劉　昀, 劉國(guó)寶

(深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

大豆ASR蛋白富含組氨酸結(jié)構(gòu)域在結(jié)合金屬離子中的作用

鄭易之, 范文靜, 劉科, 劉昀, 劉國(guó)寶*

(深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

利用固相親和層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GmASR蛋白及其含組氨酸結(jié)構(gòu)域A1～A5短肽可與金屬離子Cu2+和Cd2+結(jié)合；采用Cu-抗壞血酸體系檢測(cè)了GmASR蛋白及A1～A5清除羥基自由基的能力，證明GmASR蛋白及A1～A5短肽中組氨酸數(shù)目與清除羥基自由基能力呈正相關(guān)；GmASR蛋白及A1～A5可保護(hù)DNA分子免受Cu2+造成的氧化損傷.CD實(shí)驗(yàn)和SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GmASR蛋白及A1～A5短肽與Cu2+結(jié)合后將引起可逆性聚集及沉淀.可見GmASR蛋白通過組氨酸結(jié)合過多的金屬離子，維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，是保護(hù)植物免受重金屬毒害的重要機(jī)制之一.

GmASR蛋白； 富含組氨酸結(jié)構(gòu)域； 結(jié)合金屬離子； 清除羥基自由基； 保護(hù)DNA

ASR(abscisic acid，stress and ripening)是植物體中與滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的一類蛋白家族.植物受到非生物逆境脅迫(如低溫、干旱和高鹽脅迫等)的誘導(dǎo)，ASR蛋白將大量表達(dá)，以減輕逆境脅迫引起的植物傷害及死亡.Iusem等[1]最早從番茄(Solanumlycopersicum)中克隆了ASR1基因.隨后，其他植物中的ASR基因也陸續(xù)被克隆，如火炬松、葡萄、百合的ASR基因[2-4].大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了ASR蛋白在提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)高鹽、高滲、干旱脅迫耐受性中的貢獻(xiàn).如水稻OsAsr1基因和百合LLA23基因(ASR)的過表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)冷、高鹽、高滲和干旱脅迫的耐受性[5-6].體外實(shí)驗(yàn)中，番茄ASR1、香蕉和百合ASR蛋白可賦予乳酸脫氫酶對(duì)高溫的耐受性[7-9].本實(shí)驗(yàn)室Gao等[10]指出，Cu2+脅迫可誘導(dǎo)大豆幼苗葉和根內(nèi)GmASR基因表達(dá)上調(diào)；Li等[11]通過體外實(shí)驗(yàn)證明，GmASR蛋白可結(jié)合Fe3+、Ni2+、Cu2+和Zn2+多種離子，具有清除羥基自由基能力.

ASR蛋白屬小分子堿性蛋白，一般含70～230個(gè)氨基酸，且富含賴氨酸、谷氨酸、丙氨酸及組氨酸等親水氨基酸.ASR蛋白序列具有高保守性，通常含3～5個(gè)高保守結(jié)構(gòu)域，并且均富含組氨酸[12].組氨酸是一種可與金屬離子結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸[11].然而，ASR蛋白保守結(jié)構(gòu)域中的組氨酸是否參與金屬離子的結(jié)合還不清楚.

本文在分析大豆GmASR蛋白序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了富含組氨酸的A1～A5保守結(jié)構(gòu)域短肽；研究了GmASR蛋白及A1～A5保守結(jié)構(gòu)域短肽與Cu2+和Cd2+的結(jié)合，及其清除羥基自由基的能力；研究了GmASR蛋白及5個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)NA的保護(hù)作用及其與Cu2+結(jié)合后發(fā)生的可逆性聚集及沉淀，討論了GmASR蛋白保護(hù)植物抵御重金屬脅迫的分子機(jī)理.

1　材料與方法

1.1基因

GmASR基因的重組菌BL/pET28a-GmASR由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2方法

1.2.1GmASR蛋白的表達(dá)、分離及純化利用本實(shí)驗(yàn)室保存的含GmASR基因的重組菌BL/pET28a-GmASR，加入IPTG誘導(dǎo)該重組菌表達(dá)GmASR蛋白，并利用親和層析法分離、純化獲得GmASR目的蛋白.

1.2.2GmASR蛋白缺失短肽克隆的構(gòu)建對(duì)GmASR蛋白序列進(jìn)行分析，根據(jù)序列中保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)并合成目的短肽A1～A5(上海生工生物工程有限公司).

1.2.3固相金屬鰲合親和層析法利用固相親金屬螯合親和層析柱HiTrap Chelating HP(Amersham Pharmacia Biotech，Tokyo)分別螯合Cu2+和Cd2+，獲得metal-IMAC.再加入GmASR蛋白或短肽A1～A5，分別利用EQ buffer(50 mmol/LTris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 7.4)和250 mmol/L EDTA洗脫，收集目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳.

1.2.4DNA保護(hù)實(shí)驗(yàn)將500 ng的pET-28a DNA加入到20 μL的反應(yīng)體系液中，反應(yīng)液含有1/10 PBS(pH 7.4)，4.6 μmol/L CuCl2，300 μmol/L抗壞血酸鈉，1 μmol/L desferrioxamine和不同濃度牛血清白蛋白(BSA)、GmASR蛋白及A1～A5，37 ℃，溫育2 h,進(jìn)行核酸電泳.

1.2.5羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)利用Cu-抗壞血酸體系檢測(cè)GmASR蛋白及短肽對(duì)Cu2+催化產(chǎn)生的羥基自由基的減弱[13].配制200 μL的樣品溶液：1/10 PBS(pH 7.4)，4.6 μmol/L CuCl2，300 μmol/L抗壞血酸鈉，1 μmol/L desferrioxamine，10 mmol/L香豆素-3-羧酸(熒光檢測(cè)劑)和不同濃度的BSA、GmASR蛋白及A1～A5.加入抗壞血酸鈉啟動(dòng)該反應(yīng)，使該體系產(chǎn)生羥基自由基并產(chǎn)生熒光，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo日本)監(jiān)測(cè)30 min(395 nm激發(fā)光，452 nm發(fā)射光).利用Origin8.0軟件進(jìn)行GmASR及A1～A5的IC50值計(jì)算，IC50表示蛋白樣品的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大熒光強(qiáng)度的50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的蛋白樣品濃度，可用于衡量蛋白樣品清除羥基自由基能力.IC50值越小，則該蛋白樣品清除羥基自由基的能力越強(qiáng)，以未加入蛋白樣品時(shí)的熒光值為最大熒光值.

1.2.6圓二色光譜的測(cè)定配制500 μL的樣品溶液：1 mmol/L HEPES (pH 7.4)，50 mmol/L Na2SO4,4 μmol/L的GmASR蛋白或20 μmol/L短肽A1～A5，不同濃度(0、10、50和100 μmol/L)的CuSO4.25 ℃孵育10 min，用圓二色譜儀(J-815，Jasco公司) 測(cè)定.檢測(cè)溫度25 ℃，圓二色譜的掃描范圍250～190 nm，掃描頻率1 nm.

1.2.7SDS-PAGE法檢測(cè)GmASR及其系列短肽A1～A5聚集配制500 μL的樣品溶液：1 mmol/L HEPES (pH 7.4)，50 mmol/L Na2SO4，4 μmol/L的GmASR蛋白或20 μmol/L短肽A1～A5，50 μmol/L CuSO4，不同濃度(0、10、50和100 μmol/L)的EDTA.離心30 min，12 000 r/min，分別取上清液(S)和沉淀(P)進(jìn)行SDS-PAGE電泳.

2　結(jié)果與分析

2.1GmASR及短肽A1～A5的序列分析及其短肽設(shè)計(jì)

GmASR蛋白屬第7組LEA蛋白(LEA7).對(duì)GmASR蛋白序列分析可知其含5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[9]，各保守結(jié)構(gòu)域含數(shù)目不等的組氨酸.依據(jù)5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)GmASR系列短肽ASR1～ASR5，其長(zhǎng)度和所含組氨酸數(shù)目見圖1和表1.

圖1GmASR蛋白及其系列短肽A1～A5結(jié)構(gòu)示意圖

Figure 1Schematic illustration ofGmASR protein and the polypeptides A1～A5

2.2GmASR蛋白及短肽A1～A5可與Cu2+和Cd2+結(jié)合

利用固相金屬螯合親和層析柱-HiTrap Chelating HP分別螯合Cu2+或Cd2+，再加入GmASR蛋白及A1～A5短肽，以BSA蛋白為陽(yáng)性對(duì)照.先用EQ緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白，再用EDTA將結(jié)合Cu2+或Cd2+的蛋白從HiTrap層析柱中洗脫.收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳.圖2表明，GmASR蛋白及其短肽A1～A5均可結(jié)合Cu2+和Cd2+離子.

EQ(1 mol/L NaCl、50 mmol/LTris-HCl緩沖液，pH 7.4)洗去未結(jié)合離子的蛋白(短肽)，BSA為陽(yáng)性對(duì)照

蛋白(肽)名稱蛋白(肽)氨基酸序列蛋白(肽)中氨基酸總數(shù)/個(gè)蛋白(肽)中組氨酸數(shù)/個(gè)IC50/(μmol·L-1)GmASR(略)238220.65A1MAEEKHHKHRLFHHHKDEDQEEAHGKKHHHLFG33101.71A2MAEEKHHKHRLFHHHKDEDNKPVETDT-GYDNTSYSKPSDD4062.48A3DYKKEEKHHKHLEHLGELGAASAAAYALHEKHKAEKDPEHAHRHKIE4792.04A4FAFHEHHEKKEAKEQDEEAHGKKHHHLFG2973.30A5LHEKHKAEKDPEHAHRHKIEEEVAAAAAVGSGGFAFHEHHEK4281.86

2.3GmASR蛋白及A1～A5短肽可保護(hù)DNA免受氧化損傷

泳道1：質(zhì)粒DNA(SC：超螺旋狀)；泳道2：經(jīng)羥基自由基氧化傷害的質(zhì)粒DNA(OC：開環(huán)狀，L：呈線狀)；泳道3～5：BSA對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)作用；GmASR(泳道6～8)及短肽A1～A5(分別為泳道9～11，泳道12～14，泳道15～17，泳道18～20，泳道21～23)對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)作用. BSA、GmASR及短肽A1～A5質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、0.75 g/L

圖3GmASR蛋白及其系列短肽A1～A5保護(hù)DNA免受氧化傷害

Figure 3GmASR protein and polypeptides A1～A5 could protect DNA from oxidative damage

2.4GmASR蛋白及短肽A1～A5均可清除羥基自由基

采用Cu-抗壞血酸體系定量檢測(cè)GmASR蛋白及A1～A5短肽清除羥基自由基能力，以IC50表示(圖4).結(jié)果表明，BSA的IC50值為1.34 μmol/L.GmASR清除羥基自由基能力優(yōu)于BSA，IC50值為0.65 μmol/L.將GmASR蛋白和短肽A1～A5的氨基酸序列、蛋白(短肽)的氨基酸總數(shù)、其序列中組氨酸數(shù)目、及其清除羥基自由基能力(IC50)列于表1.

2.5Cu2+對(duì)GmASR蛋白及A1～A5短肽二級(jí)結(jié)構(gòu)表征的影響

GmASR蛋白屬固有無(wú)序蛋白(intrinsicallydisordered protein，IDP).在正常生理狀態(tài)下的GmASR主要以無(wú)序狀態(tài)存在.本文以CD光譜法檢測(cè)在不同濃度Cu2+存在時(shí)GmASR蛋白及短肽A1～A5的二級(jí)結(jié)構(gòu)表征(圖5).結(jié)果顯示，GmASR蛋白在198 nm左右出現(xiàn)一負(fù)峰，表明GmASR主要呈無(wú)序狀態(tài).在GmASR溶液中加入10 μmol/L Cu2+后，該蛋白在198 nm處的負(fù)峰變?。浑S著Cu2+濃度加大至100 μmol/L時(shí)，該處的負(fù)峰幾乎完全消失(圖5A).在短肽A1～A5溶液中加入Cu2+后，CD譜變化趨勢(shì)與GmASR蛋白相似(圖5B～5F).結(jié)果意味著Cu2+的加入可使GmASR及A1～A5短肽在溶液中的無(wú)序結(jié)構(gòu)減少.

BSA、GmASR蛋白及其系列短肽A1～A5清除羥基自由基的IC50值，數(shù)據(jù)表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值標(biāo)準(zhǔn)差.

圖4GmASR及其系列短肽A1～A5清除羥基自由基能力

Figure 4The hydroxyl radicals reducing activities ofGmASR protein and the polypeptides A1～A5

2.6GmASR及短肽A1～A5與Cu2+結(jié)合后的可逆性聚集沉淀

進(jìn)一步檢測(cè)了GmASR及短肽A1～A5與Cu2+結(jié)合后是否發(fā)生聚集、沉淀的結(jié)果(圖6)表明，在緩沖液中的GmASR蛋白及A1～A5短肽存在于上清液(S)中，沉淀中(P)未見蛋白，表明GmASR和A1～A5短肽為可溶性蛋白.在GmASR及短肽A1～A5溶液中加入50 μmol/L Cu2+后，在上清液(S)和沉淀(P)中均可檢測(cè)到GmASR及短肽A1～A5，表明Cu2+的加入可使部分GmASR及A1～A5短肽發(fā)生聚集、沉淀.在含Cu2+的GmASR及短肽A1～A5溶液中繼續(xù)加入不同濃度的EDTA，隨著EDTA濃度的提高，上清液(S)中相應(yīng)的蛋白條帶加深，而沉淀(P)中相應(yīng)的蛋白條帶變淺，意味著EDTA可螯合與GmASR蛋白及A1～A5結(jié)合的Cu2+，導(dǎo)致沉淀中的部分GmASR蛋白及A1～A5可重新恢復(fù)為可溶性蛋白.可見，Cu2+引起的GmASR及A1～A5的聚集沉淀是可逆的(圖6).

圖5　不同Cu2+濃度下GmASR蛋白及其系列短肽A1～A5的CD圖

圖6　Cu2+引起GmASR及短肽A1～A5的可逆性聚集沉淀

3　討論

植物在生長(zhǎng)過程中常受到非生物脅迫(如干旱、高鹽、重金屬脅迫)，引起細(xì)胞內(nèi)水分喪失、離子失衡及離子毒害、過氧化損傷、生物大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞等[14].有資料顯示，蛋白質(zhì)中的組氨酸是結(jié)合金屬離子的關(guān)鍵氨基酸之一.部分第二組的LEA(LEA2)蛋白序列中也富含組氨酸.如Svensson等[14]發(fā)現(xiàn)富含組氨酸的擬南芥LEA2蛋白R(shí)AB18、LTI29、LTI30和COR47可結(jié)合Cu2+和Ni2+；并且擬南芥中的LEA2蛋白ERD10、COR47和ERD14在磷酸化后可結(jié)合Ca2+[15]；蓖麻中的LEA2蛋白ITP可與幾種金屬離子結(jié)合，其結(jié)合能力依次為Fe3+>Cu2+>Zn2+>Mn2+>Fe2+[16].大豆GmASR中組氨酸含量達(dá)9.8%.本實(shí)驗(yàn)室的Gao等[10]證明異源表達(dá)的GmASR蛋白可通過其序列中的組氨酸結(jié)合Cu2+，提高轉(zhuǎn)基因植物和酵母對(duì)Cu2+脅迫的耐受性.本文的結(jié)果進(jìn)一步證明，GmASR蛋白的5個(gè)富含組氨酸的結(jié)構(gòu)域短肽均可結(jié)合Cu2+，并清除羥基自由基.

以IC50值反映短肽清除羥基自由基能力，即IC50值越小表明其清除羥基自由基能力越強(qiáng)，在GmASR蛋白的5個(gè)短肽中，A2和A5肽段的長(zhǎng)度接近(40～42氨基酸)，前者含6個(gè)組氨酸，IC50為2.48 μmol/L；后者含8個(gè)組氨酸，IC50為1.86 μmol/L，可見A5含組氨酸較多，其清除羥基自由基能力也較強(qiáng).此外，A2和A4短肽含組氨酸數(shù)目相近(6～7組氨酸)，前者為40氨基酸，IC50為2.48 μmol/L；而后者為27氨基酸，IC50為3.30 μmol/L.可見，蛋白質(zhì)(多肽)序列中組氨酸數(shù)目及肽的長(zhǎng)度與其清除羥基自由基的能力相關(guān)，這與前人報(bào)告的結(jié)果一致[13].

GmASR系列短肽A1～A5短肽不僅可結(jié)合Cu2+，還可以結(jié)合Cd2+.筆者認(rèn)為GmASR蛋白的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域都可以結(jié)合重金屬離子、具有清除羥基自由基的能力，這是GmASR蛋白提高植物細(xì)胞耐重金屬脅迫、保護(hù)DNA分子、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)免受過氧化損傷的機(jī)理之一.

已知，ASR蛋白在生理?xiàng)l件下呈無(wú)序狀態(tài). 在ASR溶液中加入Fe3+后，ASR蛋白仍保持原有的無(wú)序狀態(tài)[11].但在ASR溶液中加入Zn2+后，引起ASR蛋白的可逆性聚集及沉淀.最近發(fā)現(xiàn)，在Cu2+脅迫發(fā)生后ASR蛋白表達(dá)快速上調(diào).在本文中，觀察到GmASR蛋白結(jié)合Cu2+后發(fā)生的可逆性聚集及沉淀.可見，Cu2+脅迫后植物體內(nèi)快速表達(dá)的GmASR蛋白可緩沖細(xì)胞內(nèi)的離子失衡及離子毒害，提高細(xì)胞對(duì)脅迫的適應(yīng)性，為植物細(xì)胞采用其他保護(hù)性機(jī)制贏得了時(shí)間.這也是ASR蛋白提高植物細(xì)胞對(duì)逆境耐受性的另一種方式.

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【中文責(zé)編：成文英文責(zé)編：李海航】

The Role of Soybean ASR Protein Histidine-Rich Domain on Binding Metal Ions

Zheng Yizhi, Fan Wenjing, Liu Ke, Liu Yun, Liu Guobao*

(School of Life Science, Shenzhen University; Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering, Shenzhen 518060)

In this paper, the Cu2+and Cd2+binding properties of GmASR protein and its truncated polypeptides A1～A5 containing histidine were detected using immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). Then, the hydroxyl radicals reducing activities of GmASR protein and the polypeptides A1～A5 were determined by Cu-ascorbate system and it was found that the hydroxyl radicals reducing activities of GmASR and the polypeptides A1～A5 have a positive correlation with the number of histidine residues in their sequences. In addition, GmASR protein and polypeptides A1～A5 could protect DNA from oxidative damage caused by Cu2+.The results of CD and SDS-PAGE experiments indicated that Cu2+binding to GmASR protein would cause reversible aggregation and precipitation of the protein and polypeptidesinvitro. We speculate that GmASR can bind excess metal ions in the cytoplasm by means of the histidine-rich motifs and maintain intracellular ion balance and protect plants from heavy metal toxicity.

GmASR protein; histidine-rich domain; binding metal ions; hydroxyl radicals reducing activities; DNA protection

2015-06-19《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)資助項(xiàng)目(JCYJ20120614085333654;JCYJ20130329120339418,ZYC201105130082A)

劉國(guó)保，講師，Email:liugb@szu.edu.cn.

Q51

A

1000-5463(2015)05-0091-08