李楠宮麗鴻程修平

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110032）

·研究報(bào)告·

復(fù)方中藥對(duì)急性冠脈綜合征患者雌激素受體基因與基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因甲基化水平的影響*

李楠1宮麗鴻2△程修平1

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110032）

目的探討雌激素受體（ER）基因和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）基因甲基化水平與急性冠脈綜合征（ACS）的關(guān)系，觀察經(jīng)中西醫(yī)結(jié)合治療后的ACS患者（痰濁血瘀證）ER基因和MMP-9基因甲基化水平。方法將ACS（痰濁血瘀證）患者180例設(shè)為ACS組，另選健康正常人40例設(shè)為正常組。將ACS組患者隨機(jī)分為對(duì)照組90例和治療組90例，對(duì)照組給予PCI及西醫(yī)常規(guī)治療，治療組于PCI術(shù)后在西醫(yī)常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給予中藥湯劑口服，療程為1個(gè)月，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)ACS患者治療前后及健康人外周血細(xì)胞ER基因和MMP-9基因甲基化狀態(tài)，比較正常組與ACS組、對(duì)照組治療前后、治療組治療前后及治療組與對(duì)照組治療后ER基因和MMP-9基因甲基化水平。結(jié)果1）ACS組ER基因甲基化率明顯高于正常組（P＜0.01），MMP-9基因甲基化率明顯低于正常組（P＜0.05）；對(duì)照組與治療組經(jīng)治療后其ER基因甲基化率均明顯低于治療前（P＜0.05），對(duì)照組與治療組經(jīng)治療后其MMP-9基因基化率均明顯高于治療前（P＜0.05）；治療后治療組ER基因甲基化率低于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論ACS的發(fā)生可能與ER基因的高甲基化狀態(tài)和MMP-9基因的低甲基化狀態(tài)有關(guān)，復(fù)方中藥對(duì)ACS（痰濁血瘀證）患者M(jìn)MP-9基因與ER基因甲基化水平的雙向調(diào)節(jié)可能是其發(fā)揮臨床效用的機(jī)制之一。

復(fù)方中藥痰濁血瘀急性冠脈綜合征ERMMP-9甲基化

急性冠脈綜合征（ACS）指急性心肌缺血引起的一組臨床癥候群，主要包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死。急性心肌梗死結(jié)合心電圖表現(xiàn)進(jìn)一步分為ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死。目前認(rèn)為該病的發(fā)病是由多種因素所決定的。隨著分子生物學(xué)知識(shí)的飛躍進(jìn)展，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到個(gè)體自身的遺傳因素對(duì)冠心病的易感性起著決定性的作用［1］。DNA甲基化這一基因表遺傳學(xué)修飾現(xiàn)象作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要機(jī)制逐漸被人們認(rèn)識(shí)，修飾導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)異常，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中有重要作用。有研究報(bào)道在其發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)整體基因組的低甲基化和特殊基因的高甲基化共存現(xiàn)象［2］。

近年來(lái)，動(dòng)脈粥樣硬化的中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究主要集中于保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制血小板功能、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、改善脂質(zhì)代謝紊亂和脂質(zhì)過(guò)氧化等方面。而中醫(yī)藥干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化基因組甲基化水平的研究尚屬?lài)?guó)內(nèi)外研究空白。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠卸阂皇敲鞔_DNA甲基化異常與ACS發(fā)病的關(guān)系；二是探索搜風(fēng)祛痰方對(duì)冠心病動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因甲基化水平的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1病例選擇診斷標(biāo)準(zhǔn)：不穩(wěn)定性心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死診斷按照2007年美國(guó)心臟學(xué)會(huì)及美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)（ACC/AHA）制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)胸痹病名及證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部2002年制定發(fā)布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》及《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》第6版教材相關(guān)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)并做適當(dāng)合并，辨證為痰濁血瘀證。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合西醫(yī)急性冠脈綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)；愿意接受本研究者；符合急性冠脈綜合征中醫(yī)痰濁血瘀、痰風(fēng)內(nèi)動(dòng)證診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)者；合并有較嚴(yán)重的肝腎等器質(zhì)性病變者；各種實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤患者（因腫瘤患者亦可能存在基因組甲基化水平的異常）；納入研究前使用過(guò)去甲基化藥物者；風(fēng)濕性心臟病、甲亢性心臟病、心肌炎、心肌病等非冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病者；依從性差或因各種原因終止研究可能性大、不能完成研究流程者；病情危重，難以對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的有效性作出確切評(píng)價(jià)者。

1.2臨床資料收集曾就診于本院心內(nèi)科西醫(yī)診斷為ACS、中醫(yī)診斷為胸痹心痛（痰濁血瘀證）的患者180例，經(jīng)冠脈造影證實(shí)，結(jié)果冠脈狹窄≥50%為陽(yáng)性，體檢中心正常人40例，做為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

1.3主要試劑及實(shí)驗(yàn)材料中藥湯劑的制備：將搜風(fēng)祛痰方（全蝎10 g，蜈蚣2條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術(shù)15 g，水蛭15 g，金銀花10 g）按2000年版藥典中藥注射劑要求制成滅菌制劑，相當(dāng)于生藥含量5 g/mL，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供?；蚪MDNA提?。喝蚪MDNA提取試劑盒（北京索萊寶生產(chǎn)，貨號(hào)D1800，規(guī)格50 T/100 T）?；蚪MDNA甲基化修飾：甲基化DNA檢測(cè)試劑盒（Cat. No.CW2140，北京康為世紀(jì)提供）。甲基化特異性PCR：PCR引物合成由上海生工合成。

1.4方法1）基因組DNA提取。所有受試者空腹8 h后（急性心肌梗死患者在行急診冠脈介入治療前）留取肘靜脈血5 mL，按照全血基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶生產(chǎn)，貨號(hào)為D1800，規(guī)格為50T/100T）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：取200 μL血液樣本加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液中，充分顛倒混勻，12000 rpm離心1 min，吸去上清，沉淀應(yīng)為白色或淡紅色，向沉淀中加入試劑充分混勻，反復(fù)離心、漂洗，得到高質(zhì)量的基因組DNA樣品。將180例ACS患者隨機(jī)分為治療組與對(duì)照組。對(duì)照組在行PCI明確診斷后，給予西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)化治療（血小板抑制劑、ACEI及他汀類(lèi)藥物等）；治療組在行PCI明確診斷后，在西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)化治療的基礎(chǔ)上，加用中藥水煎劑搜風(fēng)祛痰方，日1劑，分3次口服。治療1個(gè)月后治療組與對(duì)照組再次留取肘靜脈血5 mL進(jìn)行基因甲基化水平的檢測(cè)。2）基因組DNA修飾。取每份樣品約20 μL按照甲基化DNA檢測(cè)試劑盒（Cat.No.CW 2140，北京康為世紀(jì)）進(jìn)行修飾。經(jīng)DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變，回收得到大量DNA溶液，通過(guò)結(jié)合-洗滌-洗脫步驟，從甲基化修飾后的溶液中回收純化DNA，回收的純化DNA置于-20℃保存DNA溶液，用于后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)。3）甲基化特異性PCR。首先從人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（genebank）中查找ER和MMP-9啟動(dòng)子及其上游全序列。根據(jù)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)分析其啟動(dòng)子活性位點(diǎn)，應(yīng)用專(zhuān)用工具軟件（Methyl Primer Express v1.0，Applied Biosystem公司）分析該序列的CpG島位點(diǎn)后，分析亞硫酸氫鈉修飾后的理論序列并設(shè)計(jì)如下引物，使其擴(kuò)增區(qū)域包含其啟動(dòng)子活性區(qū)域和5個(gè)CpG位點(diǎn)（見(jiàn)表1）。

表1　甲基化特異性PCR反應(yīng)的引物序列

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。率的比較運(yùn)用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組ER基因甲基化水平比較ACS組外周血細(xì)胞中ER基因的甲基化率為65.5%，高于正常組的22.5%（P＜0.01）。治療組與對(duì)照組治療后ER基因的甲基化率分別為37.1%、51.7%，均低于治療前的66.7%、63.3%（P＜0.05），治療后組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。樣本中含有甲基化ER基因序列時(shí)，M擴(kuò)增出產(chǎn)物，U未擴(kuò)增出；反之，樣本上含有非甲基化ER基因序列時(shí)，U擴(kuò)增出產(chǎn)物，M未擴(kuò)增出，見(jiàn)圖1。

圖1　ER基因甲基化電泳圖

2.2各組MMP-9基因甲基化水平比較與正常組比較，ACS組外周血細(xì)胞中MMP-9基因的甲基化率為26.1%，明顯低于正常組的45.0%（P＜0.05）。治療組與對(duì)照組治療后MMP-9基因的甲基化率分別為42.2%、40.0%，均明顯高于治療前的26.7%、25.8%（P＜0.05），與對(duì)照組治療后比較，治療組治療后MMP-9基因的甲基化率略有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。樣本中含有甲基化MMP-9基因序列時(shí)，M擴(kuò)增出產(chǎn)物，U未擴(kuò)增出；反之，樣本上含有非甲基化MMP-9基因序列時(shí)，U擴(kuò)增出產(chǎn)物，M未擴(kuò)增出（見(jiàn)圖2）。

3　討論

大量的研究證明ER介導(dǎo)的血管保護(hù)作用包括直接保護(hù)作用與間接保護(hù)作用。直接保護(hù)作用于心血管系統(tǒng)上的ER，可促進(jìn)一氧化氮合酶的合成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制血管平滑肌的增生，抑制血管的損傷，抑制巨噬細(xì)胞向動(dòng)脈粥樣硬化病變處的聚集［3-8］。間接保護(hù)作用又分為作用于肝臟與肝外：作用于肝臟的RE調(diào)節(jié)載體蛋白A、B、D、E和脂蛋白（a）基因的表達(dá)，從而升高高密度脂蛋白，降低低密度脂蛋白，并且調(diào)節(jié)某些凝血因子和纖溶蛋白基因的表達(dá)，從而減低纖維蛋白原、抗凝血酶Ⅲ的濃度等；作用于肝臟外的ER調(diào)節(jié)腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)，從而降低血中腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的濃度［9］。根據(jù)大量的研究證據(jù)，人們認(rèn)為MMP-9在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中具有多重作用：促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移到內(nèi)膜下形成粥樣斑塊，導(dǎo)致粥樣硬化斑塊的進(jìn)展；降解細(xì)胞外基質(zhì)和膠原，導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定和斑塊破裂；通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和降解參與了脂質(zhì)儲(chǔ)留、鈣質(zhì)沉著、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)行為改變等［10］。在基因水平的調(diào)節(jié)機(jī)制研究中，DNA甲基化是近年該研究領(lǐng)域的重大進(jìn)展之一，其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用值得關(guān)注。DNA甲基化是指DNA復(fù)制后在CpG島序列內(nèi)的5′胞嘧啶被甲基修飾，導(dǎo)致DNA結(jié)合蛋白與DNA主螺旋溝的結(jié)合能力降低，從而在不改變基因結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因“沉默”［11］。其主要機(jī)制為：1）基因啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化，使得基因轉(zhuǎn)錄因子不能結(jié)合到該區(qū)域；2）高甲基化區(qū)域的組蛋白乙?；富钚陨?，改變了染色體結(jié)構(gòu)，使其不易轉(zhuǎn)錄；3）甲基化的CpG島序列能募集結(jié)合有轉(zhuǎn)錄抑制作用的蛋白因子［2］。

圖2　MMP-9基因甲基化電泳圖

ACS屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛為心陽(yáng)氣虛，標(biāo)實(shí)為血瘀、痰濁。根據(jù)對(duì)ACS長(zhǎng)期的臨床觀察及治療經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為臨床中ACS主要以痰濁血瘀證為主要證型，其發(fā)病多與風(fēng)、痰、瘀、虛密切相關(guān)，胸痹總屬陽(yáng)微陰弦，因虛致痰，痰瘀交阻，郁而化熱生風(fēng)，風(fēng)挾痰瘀痹阻胸脈，發(fā)為胸痹。搜風(fēng)祛痰方由全蝎、蜈蚣、地龍、陳皮、法半夏、白術(shù)、水蛭、金銀花組成，功善搜風(fēng)祛痰，祛瘀通絡(luò)，用于治療ACS（痰濁血瘀證）。方中全蝎、蜈蚣息風(fēng)止痙，活血化瘀，通絡(luò)止痛；地龍既可清熱息風(fēng)，又能通絡(luò)止痙，共為君藥；陳皮、法半夏、白術(shù)燥濕化痰，理氣寬胸，消痞散結(jié)，共為臣藥；水蛭作為蟲(chóng)類(lèi)化瘀藥，破血力強(qiáng)而不傷新血，金銀花疏風(fēng)清熱解毒，共為佐藥。

現(xiàn)代藥理研究表明，全蝎含蝎毒，一種類(lèi)似蛇毒神經(jīng)毒的蛋白質(zhì)，蝎毒對(duì)血小板聚集功能的影響有助于減少斑塊形成，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［12］，另外全蝎提取液可通過(guò)促進(jìn)纖溶、抑制血小板聚集而抑制血栓形成［13］；蜈蚣具有增強(qiáng)心肌抗氧化能力、降低血脂、改善血液流變學(xué)指標(biāo)、調(diào)節(jié)脂代謝及保護(hù)心肌免受脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的作用，可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷，有效防治動(dòng)脈粥樣硬化的形成；地龍具有降血脂、抗菌、抗氧化、降壓、抗心律失常、抗凝血、溶血栓的作用，還具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、止咳平喘、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)傷口愈合的作用［14］；水蛭具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗腫瘤、抗癌和抗纖維化作用［15］；陳皮中黃酮類(lèi)化合物具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、抗癌和抗氧化作用［16］；法半夏可阻止或延緩食餌性高脂血癥的形成，對(duì)高脂血癥有一定的治療作用，其中對(duì)降低總膽固醇和低密度脂蛋白的作用較顯著［17］；白術(shù)具有抑制脂肪形成、抑瘤，抗炎作用和芳香化酶抑制作用［18］；金銀花具有強(qiáng)大的降血脂作用，尤其針對(duì)血清膽固醇水平，并有弱的降糖作用。

實(shí)驗(yàn)中ACS組ER基因甲基化率較正常組有明顯升高，治療后治療組與對(duì)照組ER基因的甲基化率較治療前均明顯降低，其中治療組ER基因甲基化率明顯低于對(duì)照組；ACS組MMP-9基因甲基化的率較正常組明顯降低，治療后治療組與對(duì)照組MMP-9基因的甲基化率較治療前均明顯升高，其中治療組與對(duì)照組的MMP-9基因甲基化率雖不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但治療組甲基化率稍高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ACS的發(fā)病可能與ER基因的高甲基化狀態(tài)和MMP-9基因的低甲基化狀態(tài)有關(guān)。搜風(fēng)祛痰方可降低ACS患者的ER基因的甲基化率并且升高M(jìn)MP-9基因的甲基化率，即對(duì)基因甲基化具有雙向調(diào)節(jié)作用，為中西醫(yī)結(jié)合治療ACS提供了新的作用靶點(diǎn)與科學(xué)依據(jù)。

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The Effect of Compound Chinese Medicine on Gene Methylation Level of ER Gene and MMP-9 Gene with ACS

LI Nan，GONG Lihong，CHENG Xiuping.
Liaoning University of TCM，Liaoning，Shenyang 110032，China

Objective：To study the relationship between the gene methylation level of estrogen receptor（ER），matrix metalloproteinase-9（MMP-9）and ACS，and observe the improvement of symptoms and the gene methylation level of ER and MMP-9 of combined treatment of traditional chinese and western medicine in treating ACS（phlegm and blood stasis type）.Methods：180 ACS patients diagnosed as phlegm and blood stasis type were selected as ACS group，40 normal people as the normal group.The 180 cases of ACS group were randomly divided into the control group（90 patients）and the treatment group（90 patients）.The control group took PCI and the routine western medicine（Platelet inhibitors，ACEI and Statins，ect.）.The treatment group were treated with Traditional Chinese Medicine.Treatment lasted for 1 months.MMP-9 and ER DNA methylation were detected before and after treatment in ACS patients and the normal group with methylation-specific PCR.The demethylation levels were compared among the normal group and ACS group，the control group before and after treatment，the treatment group before and after treatment，the treatment group and the control group after treatment.Results：Comparing with ACS group and the control group，there was the higher level of methylation rate of ER and the lower level of methylation rate of MMP-9 gene in the ACS patients，with statistical significance（P＜0.01）.The level of methylation rate of ER gene in both the control group and the treatment group after treatment were significantly lower than pre-treatment，with statistical significance（P＜0.05）.The levels of methylation rate of MMP-9 gene in both the control group and the treatment group after treatment were significantly higher than pre-treat-ment，with statistical significance（P＜0.05）.The methylation rate of ER gene of the treatment group after treatment was lower than that of the control group after treatment，with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：The incidence of ACS may be associated with its high methylation status of ER gene and low methylation status of MMP-9 gene.Its regulating effect of the combination of traditional Chinese and Western medicine on the gene methylation level of ACS patients（Phlegm and blood stasis type）may be one of the mechanism of clinical effect.

Compound Chinese medicine；Phlegm and Blood stasis；Acute coronary syndrome；ER；MMP-9；Methylation

R541.4

A

1004-745X（2015）10-1746-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.018

2015-06-19）

遼寧省沈陽(yáng)市科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金（F13-220-9-06）

（電子郵箱：linda1795@sina.com）