王燚霈朱瑩

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410005）

·研究報告·

三物白散對Survivin-RNA基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞的影響*

王燚霈朱瑩△

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410005）

目的觀察中藥三物白散對含存活素（Survivin）基因沉默的慢病毒顆粒（Survivin-RNAi-LV）轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞的影響。方法分別采用RT-PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）、Western blot方法檢測人胃癌SGC-7901細胞中Survivin mRNA和蛋白的表達；采用甲基噻唑基四唑（MTT）方法檢測胃癌SGC-7901細胞的增殖情況、流式細胞儀檢測凋亡率及三物白散對其增殖抑制率及凋亡率的影響。結(jié)果重組慢病毒顆粒介導(dǎo)的Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞可有效使Survivin mRNA和蛋白的表達沉默；三物白散對人胃癌SGC-7901細胞的生長具有抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞組應(yīng)用三物白散，其細胞增殖弱于、細胞凋亡率高于三物白散+空白對照組和三物白散+陰性對照組（P＜0.05）。結(jié)論含Survivin基因沉默的重組慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞，能夠抑制SGC-7901細胞Survivin的表達，三物白散對Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染后胃癌細胞的殺傷力較未轉(zhuǎn)染細胞有明顯的提高。

三物白散Survivin基因沉默胃癌SGC-7901細胞影響

本課題組前期采用三物白散加減治療進展期胃癌能明顯改善患者癥狀［1］，但仍不能達到滿意的療效，如何提高中藥的療效，成了亟需我們深入研究的課題。基因沉默是調(diào)節(jié)真核生物細胞基因表達的一種重要方法，采用基因沉默來抑制信號通路的異常表達而治療惡性腫瘤被越來越多的學(xué)者認可［2-3］。多項研究［4-6］發(fā)現(xiàn)基因沉默的方法可有效提高化療藥物對癌細胞的殺傷力，增強藥物敏感性，而能否增加中藥敏感性的報道鮮見。因此，本實驗采用含Survivin基因沉默的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞，再加不同濃度的三物白散進行實驗，初步探討三物白散對Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌細胞的影響?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1細胞株及慢病毒人胃癌細胞SGC-7901購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤研究所。含Survivin基因沉默的慢病毒顆粒由上海Genechem公司重組構(gòu)建。

1.2藥物三物白散：巴豆、浙貝母、桔梗，藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診中藥房提供，粉碎并充分混勻，調(diào)成0.005 g/mL藥物混懸液，含10%油的巴豆霜、貝母、桔梗比例為1∶3∶3，滅菌后4℃封存于玻璃安瓿。

1.3試劑DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購自于杭州四季青公司。Trizol試劑、聚合酶鏈式反應(yīng)（RTPCR）試劑盒、Western Blot試劑檢測盒（上海生工生物工程有限公司）。兔抗人一抗Survivin抗體、羊抗兔二抗IgG抗體分別購自于Santa Cruz Biotechnology美國公司、美國Abcam公司。甲基噻唑基四唑（MTT試劑）、二甲基亞砜（DMSO）分別購自美國Sigma公司、長沙凱諾生物科技有限公司；Annexin-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司）。

1.4實驗方法1）細胞培養(yǎng)。人胃癌SGC-7901細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)傳代。2）慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞。選取生長良好的處于對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細胞，每孔5×105個細胞接種于備好的6孔板中，用DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清，無抗生素），繼續(xù)培養(yǎng)細胞，當貼壁60%左右時，將SGC-7901細胞分為3組：空白對照組（DMEM培養(yǎng)基）、陰性對照LV-RNAi組（空載體慢病毒顆粒2.5× 109TU/mL）、Survivin-RNAi-LV組（含Survivin基因沉默的重組慢病毒顆粒2.5×109TU/mL），接著進行轉(zhuǎn)染，參照轉(zhuǎn)染手冊，7.0 μL/孔。轉(zhuǎn)染6 h后將濃度為10% DMEM培養(yǎng)基更換為20%，24 h后，繼續(xù)常規(guī)更換培養(yǎng)液，待6孔板被細胞長滿后，胰酶消化，進行后續(xù)PCR、蛋白檢測等實驗。3）RT-PCR檢測Survivin mRNA的表達。收集上述步驟3組的細胞，Trizol方法提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進行目的基因Survivin擴增和GAPDH內(nèi)參擴增。Survivin上游引物：5′-GCGTGAGCGGGACGTAAT-3′。下游引物：5′-GTGCCCAGGGTACGTGATG-3′，擴增長度為337 bp。內(nèi)參GAPDH。上游引物：5′-CTGCCCCTG GCAGCCCTTTC-3′。下游引物：5′-CTCTGGCCCAGCCTTCCA-3′，長度為182 bp。反應(yīng)條件：首先94℃時預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)。取5 μL PCR產(chǎn)物，電泳檢測，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進行，Quantity One軟件對凝膠成像照片進行分析，進行3次實驗，取平均值。4）Western blot檢測Survivin蛋白的表達。將2）中3組SGC-7901細胞，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，去PBS液，在冰上裂解細胞，提取80～100 μg總蛋白，在10% SDS-PAGE膠上電泳，通過恒流電1.5 h轉(zhuǎn)移印跡到聚偏二氟乙烯膜（polyvinyli-dene fluoride，PVDF膜），用TBST配制成5%脫脂牛奶，加入兔抗人Survivin一抗，常溫下孵育2 h，置于羊抗兔IgGⅡ抗體（稀釋1∶2000）中，常溫下繼續(xù)孵育2 h，TBST液洗膜，重復(fù)洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光液中進行顯色曝光處理。5）MTT法檢測三物白散對Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞后抑制率的影響。實驗設(shè)3組：中藥組（三物白散+空白對照組）、中藥+LV-RNAi組、中藥+ Survivin-RNAi-LV組，接種各組細胞到96孔板，每孔1×104個/100 μL，各組設(shè)置3個復(fù)孔。3組分別加入不同濃度同體積的中藥三物白散（3.5、7.0、14.0 mg/mL）200 μL/孔。48 h后，每孔加入MTT試劑約20 μL，濃度5 mg/mL，繼續(xù)恒溫孵箱孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO），每孔加150 μL，低速震蕩10 min。全自動酶標儀測波長490 nm處每孔吸光值（A值）。抑制率以（1-A實驗孔均值/A對照組均值）×100%表示。計算3個復(fù)孔的平均值。6）流式細胞儀檢測三物白散對Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染后胃癌SGC-7901細胞凋亡率的影響。實驗設(shè)3組：中藥組（三物白散+空白對照組）、中藥+LV-RNAi組、中藥+Survivin-RNAi-LV組，接種到6孔板，每孔接種5×104個/200 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔。每組分別加入不同濃度同體積的中藥三物白散（3.5、7.0、14.0 mg/mL）200 μL/孔。37℃培養(yǎng)48 h，胰酶消化各組細胞，收集于EP管中，PBS液洗滌3次，然后離心，收集棄上清后的細胞，采用Annexin VFITC/PI法檢測三物白散處理后胃癌細胞凋亡率。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示。兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。多組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Survivin基因沉默Survivin mRNA表達的檢測見圖1。與空白對照組、陰性對照組相比，Survivin-RNAi-LV組條帶明顯變窄，Survivin-RNAi-LV組、陰性對照空載體慢病毒顆粒組和空白對照組Survivin mRNA的表達量分別為（0.15±0.04）、（1.02±0.09）、（1.08±0.14），Survivin-RNAi-LV組mRNA的表達量分別為陰性對照LV-RNAi組和空白對照組的14.71%和13.89%，干擾效率分別為85.29%和86.11%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而陰性對照LV-RNAi組和空白對照組的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含Survivin基因沉默重組慢病毒轉(zhuǎn)染SGC-7901能有效降低內(nèi)源性Survivin mRNA的表達。

2.2慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞Survivin蛋白的表達見圖2。Western blot檢測慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞Survivin蛋白的表達，與空白對照組（培養(yǎng)基）、陰性對照LV-RNAi組（空載體慢病毒顆粒2.5×109TU/mL）相比，Survivin-RNAi-LV組蛋白條帶減弱，Survivin-RNAi-LV組Survivin蛋白的表達量（0.21±0.08）低于空白對照組（0.69±0.06）和陰性對照LV-RNAi組（0.71±0.04），Survivin-RNAi-LV組Survivin蛋白表達量下降了69.57%和70.42%，陰性對照LV-RNAi組和空白對照組的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含Survivin基因重組慢病毒轉(zhuǎn)染SGC-7901能有效降低內(nèi)源性Survivin蛋白的表達。

圖1　Survivin基因沉默Survivin mRNA表達的檢測

圖2　慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞Survivin蛋白的表達

2.3MTT比色法檢測Survivin基因沉默后對三物白散敏感度的影響見表1。MTT法檢測Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞后用三物白散處理，觀察各組細胞的抑制率，觀察發(fā)現(xiàn)，中藥+Survivin-RNAi-LV組能明顯抑制胃癌細胞增殖，抑制率明顯高于中藥組和中藥+LV-RNAi組，且隨著三物白散濃度的不同抑制率逐漸升高，提示Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染后能增強對三物白散的敏感性，且與藥物濃度呈正相關(guān)性，而中藥組和中藥+LV-RNAi組兩組的細胞抑制率無明顯差異。

表1　MTT法檢測轉(zhuǎn)染后三物白散對細胞的抑制率（%，±s）

表1　MTT法檢測轉(zhuǎn)染后三物白散對細胞的抑制率（%，±s）

與中藥組、中藥+LV-RNAi組比較，*P＜0.05。下同。

藥物濃度（mg/mL）n中藥+Survivin-RNAi-LV組中藥組中藥+LV-RNAi組3.5350.46±3.14*7.0378.52±2.67*29.18±3.5930.95±2.07 41.36±3.4843.07±3.05 14.0389.31±4.35*48.53±4.2349.72±3.89

2.4流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡見圖3，表2。流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)的Survivin基因沉默組的細胞凋亡率明顯高于單用中藥未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組，且隨著三物白散濃度的增高，其凋亡率亦升高，表明三物白散對Survivin基因沉默后胃癌細胞的凋亡具有明顯的促進作用。

圖3　各組細胞凋亡率檢測結(jié)果

表2　流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率（%，±s）

表2　流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率（%，±s）

藥物濃度（mg/mL）n中藥+Survivin-RNAi-LV組中藥組中藥+LV-RNAi組3.5314.7±1.2*7.0320.1±2.6*2.3±0.92.5±0.4 4.7±0.64.6±0.8 14.0327.9±1.7*7.2±1.17.4±0.5

3　討論

中醫(yī)學(xué)認為，胃癌歸屬于“胃脘痛”“噎嗝”“癥瘕”“積聚”等范疇，病因病機主要有氣滯、食積、痰瘀、毒聚、正虛等方面。中醫(yī)在治療該病方面有上千年的歷史，中藥已被肯定具有較好的治療效果且毒副作用較小，中醫(yī)辨證診治有利于提高患者的生存質(zhì)量和延長患者的生命［11］。經(jīng)方三物白散是出自張仲景的《傷寒論·太陽病脈證并治》篇的方劑，由貝母、巴豆和桔梗含為一方，方中貝母化痰散結(jié)，《本草正義》言“象貝母蓄寒泄降，而能散結(jié)”。巴豆性熱味辛并有毒，《神農(nóng)本草經(jīng)》謂其“破癮瘕結(jié)聚堅積，留飲痰癖，大腹水腫。蕩練五臟六腑，開通閉塞，利水谷道。去惡肉”。桔梗開肺提氣，既可祛痰散結(jié)開肺，又可行藥力于上，現(xiàn)代藥理研究認為其有增強人體抵抗力的作用；三藥共用，共達溫下逐瘀、散寒除實、滌痰破結(jié)之功。前期我們使用經(jīng)方三物白散加味治療胃癌收到了較好的療效［3］，且初步進行了研究，發(fā)現(xiàn)三物白散治療胃癌的機制與Survivin基因有關(guān)［12-13］。

Survivin是凋亡抑制蛋白（IPA）家族中最受重視的新成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強大的凋亡抑制因子，對細胞存活至關(guān)重要，故又成為生存素、存活素。在正常細胞內(nèi)，Survivin的表達受到嚴格的控制，而在胃腸癌、肺癌、乳腺癌等癌細胞中，Survivin呈高表達［14］。已有多項研究檢測胃癌組織中Survivin基因的表達，以探討Survivin基因表達與胃癌的相關(guān)性。Da等［15］采用免疫組化方法分別檢測正常胃黏膜、腸化生黏膜、不典型增生胃黏膜、胃癌組織中YAP蛋白和Survivin基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Survivin基因在胃癌組織中表達呈強陽性。

近幾年來隨著科技的發(fā)展，RNA干擾（RNAi）技術(shù)、基因沉默抗癌癥的研究也不斷地增加。RNAi技術(shù)對于特定基因的表達，可以特異性地剔除或關(guān)閉。慢病毒（Lentivirus）載體技術(shù)，無論細胞是否處于分裂期，均可將外源基因或外源的shRNA有效地轉(zhuǎn)染到宿主染色體上，從而達到持久穩(wěn)定的沉默效應(yīng)，具有高特異性、高效性、高穩(wěn)定性和低毒性、無病毒蛋白表達［16］的優(yōu)勢，促進了基因組學(xué)的發(fā)展。

本研究采用通過Survivin-RNAi-LV轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞，分為實驗組（含Survivin基因沉默的慢病毒顆粒組）、陰性對照組（空載體轉(zhuǎn)染組）、空白對照組（未轉(zhuǎn)染組）3組，檢測到Survivin mRNA和Survivin蛋白在Survivin-RNAi-LV組細胞中的表達水平較另2組明顯下降，而空白對照組和陰性對照LVRNAi組中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明重組慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染細胞可以有效沉默Survivin，證實含Survivin基因沉默的重組慢病毒轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功。構(gòu)建轉(zhuǎn)染細胞株后進行了后續(xù)三物白散對轉(zhuǎn)染后胃癌細胞增殖及凋亡的影響實驗，分為中藥組、中藥+LVRNAi組、中藥+Survivin-RNAi-LV組6組，發(fā)現(xiàn)中藥+ Survivin-RNAi-LV組三物白散對細胞的殺傷作用高于中藥+LV-RNAi組和中藥組，且隨著藥物濃度的增高，其殺傷作用亦增強。

綜上所述，含Survivin基因沉默慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞，可以降低Survivin基因和蛋白的表達，再以不同濃度的三物白散處理，癌細胞增殖抑制率及凋亡率與藥物濃度呈正比；提示三物白散對于Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌細胞具有較強的殺傷力，而對于普通胃癌細胞的殺傷力較弱；提示我們可通過基因沉默的方法來增強中藥對于腫瘤的治療作用，但其具體作用機制尚不明確，需要課題組進一步研究。

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The Effect of Sanwubai Powder on Gastric SGC-7901 Cells Transfected by Survivin-RNA gene Silencing

WANG Yipei，ZHU Ying.
The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To observe the effect of Sanwubai Powder on human gastric cancer SGC-7901 cells containing survivin（Survivin）gene silencing transfected by Lentiviral Particles（Survivin-RNAi-LV）.Methods：The methods of RT-PCR and Western blot were used to detecte the expression of survivin gene mRNA and survivin protein.The method of MTT was used to detect the proliferation of SGC-7901 cells，and the flow cytometry was uesed to test the apoptosis rate and the effects of Sanwubai powder on proliferation inhibition rate and apoptosis rate.Results：Recombinant lentiviral particle-mediated Survivin gene silencing transfecting human gastric cancer SGC-7901 cells could effectively silence the expression of Survivin mRNA and protein.Sanwubai Powder could inhibit the growth and induce apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells.The cell proliferation in Survivin gene silencing transfecting into gastric cancer SGC-7901 cells group using Sanwubai Powder was weaker than Sanwubai Powder+blank control group and San Wu Bai San+negative control group（P＜0.05），while apoptosis rate was higher than.Conclusion：Recombinant Lentiviral Particles transfecting human gastric cancer SGC-7901 cells，containing Survivin gene silencing，can inhibit the expression of Survivin mRNA and protein in SGC-7901 cells.The lethality of Sanwubai Powder on gastric cancer cells in the group of Survivin gene silencing transfection has more significantly improved than that in the non-transfected cells.

Sanwubai Powder；Survivin gene silencing；Gastric cancer；SGC-7901 cell；Effect

R730.59

A

1004-745X（2015）10-1758-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.022

2015-04-15）

湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年基金資助項目

（電子郵箱：zhuying089@126.com）