曾怡 史夢琪 楊歡 何萍 王有為 杜俊蓉

·論著·

除濕止癢軟膏抗炎及止癢作用研究

曾怡 史夢琪 楊歡 何萍 王有為 杜俊蓉

目的 探討除濕止癢軟膏的抗炎及止癢作用。方法 用2，4-二硝基氟苯（DNFB）腹部致敏和背部反復激發(fā)建立BALB/c小鼠特應性皮炎模型。實驗動物分為正常對照組（未致敏也未治療）、模型對照組（致敏但未治療）、氫化可的松乳膏組（致敏+氫化可的松）、除濕止癢軟膏組（致敏+除濕止癢軟膏）。連續(xù)用藥14 d，末次給藥12 h后取背部皮膚，測定皮膚厚度及質量，進行HE染色和甲苯胺藍染色，ELISA法檢測皮損組織中干擾素（IFN）γ、腫瘤壞死因子（TNF）α、白細胞介素（IL）-4、IL-5含量。利用磷酸組胺誘發(fā)Hartley豚鼠局部皮膚瘙癢模型，觀察除濕止癢軟膏對豚鼠致癢閾的影響。結果 用藥后第15天，與模型對照組相比，氫化可的松乳膏和除濕止癢軟膏均可明顯減少小鼠的背部皮膚厚度和質量（P<0.01），減少淋巴細胞和肥大細胞浸潤（P<0.01）以及降低皮損組織中IFN-γ、TNF-α、IL-4及IL-5水平（P<0.05或P<0.01）。與正常對照組相比，氫化可的松乳膏組小鼠背部皮膚厚度和質量減?。≒<0.01），除濕止癢軟膏組無明顯變化。此外，除濕止癢軟膏也可顯著提高豚鼠耐受磷酸組胺的致癢閾（P<0.01）。結論 除濕止癢軟膏可明顯抑制DNFB引起的小鼠特應性皮炎，其抗炎機制可能與恢復體內Th1/Th2型細胞因子平衡有關。除濕止癢軟膏可明顯減輕磷酸組胺所致豚鼠皮膚瘙癢反應。

皮炎，特應性；抗炎藥（中藥）；止癢藥；組胺；除濕止癢軟膏

作者單位：610041成都，四川大學華西藥學院藥理系（曾怡、史夢琪、楊歡、何萍、杜俊蓉）；四川省醫(yī)學科學院、四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所（王有為）

目前臨床上治療特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）以外用糖皮質激素和口服抗組胺藥為主，長期使用不良反應明顯。除濕止癢軟膏由蛇床子、苦參、黃連、黃柏、白鮮皮、虎杖、紫花地丁、地膚子、萹蓄、茵陳、蒼術、花椒、冰片十三味中藥組成，有清熱除濕、祛風止癢功效，臨床上已用于治療濕疹［1-2］。本實驗通過2，4-二硝基氟苯（DNFB）誘導小鼠AD模型和磷酸組胺誘發(fā)豚鼠局部瘙癢模型，評價除濕止癢軟膏的抗炎及止癢作用。

資料與方法

一、材料

1.實驗動物：Hartley豚鼠24只，雌雄各半，體重（222.6±26.1）g，由成都彭縣養(yǎng)殖場提供，合格證號0007476。SPF級8周齡BALB/c雄鼠40只，體重（22.9±1.5）g，由成都達碩生物科技有限公司提供，合格證號0003282。

2.實驗藥品：除濕止癢軟膏（規(guī)格0.777 g生藥/g膏，成都明日制藥有限公司，批號140803）；氫化可的松乳膏（10 g∶10 mg，天津金耀藥業(yè)有限公司，批號 12041337）；賽庚啶乳膏（10 g∶50 mg，湖南五洲通藥業(yè)有限責任公司，批號130630）；DNFB（成都格雷西亞化學技術有限公司，批號D16877），溶于丙酮橄欖油溶液（4∶1）中配成0.15%DNFB溶液；磷酸組胺（成都科龍化工試劑廠，批號201312）；Na2S·9H2O（成都市科龍化工試劑廠，批號20130844），脫毛劑配方：8 g Na2S·9H2O用溫水60 ml溶解后，加入40 ml 75%乙醇配制而成。

3.主要試劑及設備：小鼠IL-5ELISA試劑盒（美國RB公司），小鼠IL-4、小鼠IFN-γ、小鼠TNF-α ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；外徑千分尺（青海量具刃具有限責任公司），全波長多功能酶標儀（美國ThermoFisher公司）。

二、小鼠 AD 模型實驗［3-4］

1.實驗分組及小鼠AD模型建立：將40只BALB/c小鼠按體重分為正常對照組、模型對照組、氫化可的松乳膏組、除濕止癢軟膏組，每組10只。實驗前1天均剃除并脫去小鼠腹部毛發(fā)，面積約2 cm×3 cm；第1天，實驗組小鼠均于腹部脫毛處外涂100μl 0.15%DNFB致敏，正常對照組外涂100 μl丙酮橄欖油溶液；第3天均剃除并脫去小鼠背部毛發(fā)，面積約2 cm×3 cm；第7天，實驗組小鼠于背部脫毛處涂100 μl 0.15%DNFB激發(fā)，正常對照組外涂100 μl丙酮橄欖油溶液，每周激發(fā)2次，連續(xù)4周。共激發(fā)9次。

2.給藥方案：造模成功24 h后開始給藥，給藥時程為14 d。除濕止癢軟膏每天3次（9：00/15：00/21：00），每次 0.04 g；氫化可的松乳膏每天 2 次（9：00/21：00），每次0.04 g；模型對照組和正常對照組同時給予100 μl生理氯化鈉液，每天3次。用藥第8天給予100 μl 0.15%DNFB進行第10次激發(fā)。

3.觀察指標：末次給藥12 h后，小鼠斷頸處死并作以下處理：①選取小鼠背部皮膚3個不同固定部位，用8 mm金屬打孔器打孔，去除皮下脂肪組織后立即用外徑千分尺測量厚度，分析天平稱重；②背部皮膚標本制成10%組織勻漿，ELISA法測定上清液中 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5含量，以 1 g/L 勻漿組織中細胞因子含量作為相對細胞因子含量［5］；③背部皮膚標本4%甲醛固定、石蠟包埋、切片，HE染色和甲苯胺藍染色，高倍鏡（×400）下取10個HE染色切片無重疊視野計數淋巴細胞，100倍鏡下取5個甲苯胺藍染色切片無重疊視野計數肥大細胞。

三、局部瘙癢模型實驗［6］

將24只Hartley豚鼠按體重隨機分為模型對照組、賽庚啶乳膏組、除濕止癢軟膏組，每組8只。實驗前1天將豚鼠右后足背剪毛并脫毛，面積約1 cm×1 cm，并在脫毛處涂藥1次，0.03 g/只。實驗當日將脫毛處皮膚用細砂紙輕輕擦傷，使之發(fā)紅，但以不出血為度，再給藥1次。10 min后開始在創(chuàng)面處滴0.01%磷酸組胺溶液，以后每隔3 min以0.02%、0.03%、0.04%……遞增濃度，每次 30 μl，直至豚鼠回頭舔右后足，以此時給予的磷酸組胺總量為致癢閾，比較各組致癢閾差異。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、藥物對各組小鼠皮膚厚度及質量的影響

用藥后第15天，氫化可的松乳膏組皮膚萎縮，皮膚厚度和質量均減小，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。除濕止癢軟膏組小鼠皮膚質量和厚度均已恢復至正常，與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

二、藥物對各組小鼠皮膚組織結構的影響

小鼠AD模型建立后，背部皮膚出現增厚、紅斑、水腫、厚痂（圖1A）。用藥后第7天，模型對照組部分痂皮脫落，有鱗屑、中度紅斑及水腫（圖1B）；氫化可的松軟膏組背部有輕度紅斑，水腫消去（圖1C）；除濕止癢軟膏組仍有輕度紅斑及水腫，無明顯痂皮（圖1D）。用藥后第15天，模型對照組背部皮損程度（圖1F）基本同第7天，HE染色可見表皮突下延，表皮細胞中度水腫，棘層、顆粒層肥厚，角化過度伴角化不全；真皮層大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞為主（圖2B），可見肥大細胞。氫化可的松乳膏組紅斑水腫消失，皮膚變薄皺縮（圖1G），真皮層細胞層數減少，與模型對照相比，淋巴細胞（圖2C）和肥大細胞浸潤均減輕（P＜0.01）。除濕止癢軟膏組輕度紅斑，水腫消失，表皮增厚不明顯（圖1H），與模型對照相比，真皮層淋巴細胞（圖2D）和肥大細胞浸潤均減輕（P＜0.01）。淋巴細胞和肥大細胞計數結果見表1。

三、藥物對各組小鼠皮損組織勻漿細胞因子水平的影響

與正常對照組相比，模型對照組 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5 水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；氫化可的松乳膏和除濕止癢軟膏組4類細胞因子恢復正常，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組相比，氫化可的松乳膏和除濕止癢軟膏均可明顯抑制這4類細胞因子水平升高（P＜0.01或P＜0.05），且氫化可的松乳膏對TNF-α抑制作用強于除濕止癢軟膏（P＜0.05）。見表2。

表1 用藥后第15天對特應性皮炎小鼠皮膚質量及厚度、皮損淋巴細胞及肥大細胞的影響（±s）

表1 用藥后第15天對特應性皮炎小鼠皮膚質量及厚度、皮損淋巴細胞及肥大細胞的影響（±s）

注：組間多重比較，a：與正常對照組相比，P＜0.01；b：與模型對照組相比，P＜0.01

組別 只數正常對照組 10模型對照組 10氫化可的松乳膏組 10除濕止癢軟膏組 10 F 藥物（P 值）F 區(qū)組（P 值）肥大細胞（個/mm2）23.04±1.11 0.677±0.025 128.3±17.2 7.5±0.6 39.06±1.90a 1.073±0.040a 488.6±43.8a 42.9±1.1a 13.52±0.44ab 0.293±0.011ab 205.6±11.4ab 18.7±2.5ab 25.02±1.25b 0.748±0.036b 252.9±13.7ab 22.8±2.5ab 66.040（0.000） 108.189（0.000） 25.763（0.000） 50.808（0.000）0.932（0.660） 0.845（0.626） 0.782（0.684） 1.580（0.160）皮膚質量（mg）皮膚厚度（mm）淋巴細胞（個/mm2）

表2 用藥后第15天對特應性皮炎小鼠組織勻漿相對細胞因子含量的影響（±s） ng/L

表2 用藥后第15天對特應性皮炎小鼠組織勻漿相對細胞因子含量的影響（±s） ng/L

注：a：與正常對照組相比，P ＜ 0.05；b：與正常對照組相比，P ＜ 0.01；c：與模型對照組相比，P ＜ 0.01；d：與模型對照組相比，P ＜ 0.05；e：與氫化可的松乳膏相比，P ＜ 0.05

干擾素γ 腫瘤壞死因子α 白細胞介素4 白細胞介素5 22.98±3.39 332.03±52.59 44.48±5.86 10.58±1.58 57.22±9.09a 617.25±48.45b 77.62±5.96b 14.84±1.12a 17.26±2.38c 255.48±64.65c 38.40±10.74d 8.03±1.01c 25.96±2.68d 415.11±49.01de 52.05±2.09c 9.77±0.58c 6.470（0.003） 6.899（0.002） 4.741（0.007） 5.599（0.003）0.806（0.655） 0.911（0.589） 0.560（0.885） 1.052（0.430）組別 只數正常對照組 10模型對照組 10氫化可的松乳膏組 10除濕止癢軟膏組 10 F 藥物（P 值）F 區(qū)組（P 值）

圖1 小鼠特應性皮炎模型皮損及用藥后第7、15天各組小鼠皮損情況 1A：建模后小鼠背部出現增厚、潮紅、水腫、厚痂；1B：模型對照組第7天痂皮脫落，有鱗屑，中度紅斑及水腫；1C：氫化可的松乳膏組第7天小鼠背部有輕度紅斑，水腫消去；1D：除濕止癢軟膏組第7天仍有輕度紅斑及水腫，無明顯痂皮；1E：正常對照組第15天；1F：模型對照組第15天背部皮損程度基本同第7天；1G：氫化可的松乳膏組第15天紅斑水腫消失，皮膚變薄皺縮；1H：除濕止癢軟膏組第15天輕度紅斑，水腫消失，表皮增厚不明顯

圖2 用藥后第15天各組小鼠皮損HE染色（×100） 2A：正常對照組；2B：模型對照組表皮增厚明顯，大量炎癥細胞浸潤；2C：氫化可的松乳膏組炎癥細胞浸潤減少；2D：除濕止癢軟膏組炎癥細胞浸潤減少

四、藥物對磷酸組胺誘發(fā)豚鼠局部瘙癢的影響

與模型對照組相比，除濕止癢軟膏和賽庚啶乳膏均可明顯提高豚鼠耐受磷酸組胺的致癢閾（P<0.01或P<0.05）。見表3。

表3 除濕止癢軟膏對磷酸組胺所致豚鼠瘙癢反應的影響（±s）

表3 除濕止癢軟膏對磷酸組胺所致豚鼠瘙癢反應的影響（±s）

注：與模型對照組相比，a：P<0.05；b：P<0.01

組別 只數模型對照組 8賽庚啶乳膏組 8除濕止癢軟膏組 8 F 藥物（P 值）F 區(qū)組（P 值）致癢閾（μg） 涂抹次數21.3±6.5 2.9±0.5 134.3±50.6a 7.5±1.4a 201.3±44.2b 9.8±1.3b 4.895（0.022） 7.820（0.004）0.374（0.931） 0.379（0.929）

討 論

中醫(yī)認為AD是先天稟性不耐而素體熱耐；或后天脾失健運或營血不足，復感風濕熱邪，風燥濕熱郁結于肌膚而發(fā)?。?］。近年來，Th1/Th2失衡學說成為該病發(fā)病機制研究熱點。一般認為急性階段以Th2型免疫反應為主，細胞因子如IL-4、IL-5表達增加，隨著病程發(fā)展，逐漸轉以Th1型免疫反應為主，且搔抓可誘導這一過程的轉化［8-9］?？乖N類，接觸劑量、頻率、劑量和途徑等均可影響Th1/Th2平衡偏倚方向［10］。本研究建立的小鼠AD模型具有潮紅、結痂和鱗屑、肥厚、苔蘚化、浸潤等特點，被認為處于亞急性階段。AD模型對照組皮損組織IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5 水平均增加，呈現 Th1、Th2 混合型變態(tài)反應，與已有文獻［4］結果一致。有文獻［2］報道，該模型細胞因子表達呈Th2優(yōu)勢型，我們認為可能與本實驗中使用的DNFB激發(fā)劑量更大有關。用藥后第15天后，除濕止癢軟膏和氫化可的松乳膏均可明顯減輕小鼠的皮膚水腫和炎癥細胞浸潤，不同程度恢復皮損組織中上述4類細胞因子水平，提示其抗炎作用可能與糾正Th1/Th2平衡相關。與氫化可的松乳膏不同的是，除濕止癢軟膏并未引起皮膚萎縮，且對TNF-α抑制作用弱于氫化可的松乳膏。對TNF-α抑制作用的差異可能是兩種藥物治療強度不同的原因之一，其具體機制有待進一步探討。

瘙癢是各類皮炎濕疹的一個重要特征，也是影響患者生活質量的關鍵所在。組胺是最早發(fā)現的瘙癢介質之一。在小鼠AD模型中，除濕止癢軟膏可減少皮損組織肥大細胞浸潤，提示該藥還可能抑制組胺釋放。因此，本實驗建立外源性磷酸組胺誘發(fā)豚鼠局部瘙癢模型，結果證實除濕止癢軟膏確可顯著抑制磷酸組胺所致豚鼠皮膚的局部瘙癢。

本文結果表明，除濕止癢軟膏對DNFB誘導小鼠AD模型及磷酸組胺誘導豚鼠局部瘙癢模型具有良好的治療作用，值得進一步分析其抗炎止癢有效成分、考察量效關系，進而優(yōu)化配方及開發(fā)新劑型，以發(fā)揮更大的臨床應用價值。

聲明 本研究由成都明日制藥有限公司資助

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·讀者·作者·編者·

本刊2016年重點號征稿啟事

2016年《中華皮膚科雜志》初步計劃組織免疫性皮膚病重點號（第1期），銀屑病重點號（第4期），性傳播疾病重點號（第5期），真菌病?？ǖ?期），設述評、專家論壇、專家筆談、指南與共識、論著、綜述、病例報告、來信、臨床病例診治經驗及討論等欄目，特向全國各醫(yī)院皮膚性病科及相關學科臨床及科研人員征稿，各欄目文稿要求見本刊稿約。歡迎投稿。

Anti-inflammatory and antipruritic effects ofChushizhiyangointment

Zeng Yi*,Shi Mengqi,Yang Huan,He Ping,Wang Youwei,Du Junrong.*Department of Pharmacology,West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China

ObjectiveTo explore the anti-inflammatory and antipruritic effects ofChushizhiyangointment in a mouse model.MethodsA total of 40 male 8-week-old BALB/c mice were included in this study,and randomly and equally divided into 4 groups.A mouse model of atopic dermatitis（AD）was established in three groups of mice by repeated application of 2,4-dinitroflurobenzene（DNFB）to shaved abdominal skin for sensitization and to shaved dorsal skin for stimulation.After establishment of the AD model,the three groups were topically treated with sodium chloride physiological solution （model group）,hydrocortisone cream （hydrocortisone group）andChushizhiyangointment（Chushizhiyanggroup）respectively for 14 consecutive days.The remaining group receiving no sensitization or treatment served as the normal control group.All the mice were sacrificed 12 hours after the final treatment,and the dorsal skin of mice was resected followed by the determination of skin thickness and weight as well as hematoxylin-eosin（HE）staining and toluidine blue staining for the counting of leukocytes and mast cells respectively.Moreover,enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to measure the levels of interferon-gamma（IFN-γ）,tumor necrosis factor alpha（TNF-α）,interleukin 4（IL-4）and IL-5 in dorsal skin lesions.In addition,a local skin itching model was induced by histamine phosphate in Hartley guinea pigs,which was used to explore the effect ofChushizhiyangointment on itch thresholds.ResultsCompared with the model group,both theChushizhiyanggroup and hydrocortisone group showed reduced thickness and weight of dorsal skin in mice （allP<0.01）,numbers of infiltrating lymphocytes and mast cells（allP<0.01）and levels of IFN-γ,TNF-α,IL-4 and IL-5 in skin lesions （P<0.05 or 0.01）on day 15 after the start of treatment.The thickness and weight of dorsal skin in mice were significantly decreased in the hydrocortisone group（P<0.01）,but experienced no significant changes in theChushizhiyanggroup compared with the normal control group.Additionally,Chushizhiyangointment could significantly increase itch thresholds in guinea pigs induced by histamine phosphate（P<0.01）.ConclusionsChushizhiyangointment can significantly inhibit DNFB-induced AD in mice,likely by restoring the balance between Th1 and Th2 type cytokines.Moreover,Chushizhiyangointment could markedly relieve itching induced by histamine phosphate in guinea pigs.

Dermatitis,atopic;Anti-inflammatory drugs （TCD）;Antipruritics;Histamine;Chushizhiyang ointment

s:Wang Youwei,Email:wangyouwei2000@163.com;Du Junrong,Email:dujr_1@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.011

王有為，Email：wangyouwei2000@163.com；杜俊蓉，Email：dujr_1@163.com

2015-02-12）

（本文編輯：吳曉初）