趙敏玲 劉仲榮 陳胡林 朱英杰 嚴(yán)苗苗 范秀針

川芎嗪對(duì)UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的拮抗作用及MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)影響

趙敏玲 劉仲榮 陳胡林 朱英杰 嚴(yán)苗苗 范秀針

目的 探討川芎嗪對(duì)長(zhǎng)波紫外線（UVA）誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）衰老的拮抗作用及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1和MMP-3 mRNA表達(dá)的影響。方法 酶消化法分離HDF進(jìn)行原代培養(yǎng)，用不同濃度川芎嗪分別作用UVA多次照射前后的HDF。CCK-8法檢測(cè)川芎嗪作用24、48、72 h或川芎嗪預(yù)處理24 h進(jìn)行多次UVA照射的各組HDF體外增殖情況。光學(xué)顯微鏡下觀察經(jīng)多次UVA照射的各組細(xì)胞形態(tài)變化及β半乳糖苷酶染色情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)MMP-1和MMP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 濃度為20、50 mg/L的川芎嗪作用HDF 24、48、72 h對(duì)細(xì)胞的體外增殖活性無(wú)促進(jìn)或抑制作用，但100 mg/L作用48 h對(duì)HDF出現(xiàn)短暫抑制作用，與未給藥組比較細(xì)胞增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。20、50、100 mg/L的川芎嗪預(yù)處理HDF 24、48、72 h對(duì)經(jīng)多次UVA照射的HDF體外增殖均有一定的促進(jìn)作用，各組間細(xì)胞增殖活性在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為17.451，15.231，23.535，均P＜0.01）。多次UVA照射后HDF形態(tài)出現(xiàn)體積變大、顆粒增加及β半乳糖苷酶表達(dá)增加等衰老現(xiàn)象，接近復(fù)制性衰老的HDF（P55組）。而20、50、100 mg/L的川芎嗪預(yù)處理HDF 24 h可減輕這種衰老現(xiàn)象，其中UVA組β半乳糖苷酶陽(yáng)性率（68.417± 1.181）%，UVA＋川芎嗪20 mg/L組（58.167±5.620）%，UVA＋川芎嗪50 mg/L組（45.167±5.502）%，UVA＋川芎嗪100 mg/L組（43.000±2.000）%，未照射組（33.667±5.865）%，P55組（76.000±6.557）%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.918，P＜0.01），且UVA＋各濃度川芎嗪組、未照射組與UVA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。川芎嗪可降低多次UVA照射誘導(dǎo)的HDF表達(dá)MMP-1和MMP-3 mRNA，且UVA＋各濃度川芎嗪組、未照射組與UVA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 川芎嗪對(duì)多次UVA照射誘導(dǎo)的HDF衰老有拮抗作用，并能降低HDF衰老過(guò)程中MMP-1和MMP-3 mRNA的表達(dá)。

川芎嗪；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞衰老；基質(zhì)金屬蛋白酶1；基質(zhì)金屬蛋白酶3；紫外線；細(xì)胞增殖

人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）能維持皮膚的彈性及水分，皮膚老化出現(xiàn)松弛、干燥粗糙、彈性下降、皺紋增多等現(xiàn)象都與HDF的數(shù)量減少及分泌合成功能下降有關(guān)［1-2］。長(zhǎng)波紫外線（UVA）穿透力強(qiáng)，引起成纖維細(xì)胞損傷，長(zhǎng)期反復(fù)照射，引起衰老相關(guān)標(biāo)志物β半乳糖苷酶表達(dá)增加，還誘導(dǎo)HDF表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）增加。MMP是降解皮膚膠原纖維的主要因子，可促進(jìn)皮膚光老化現(xiàn)象的發(fā)生［3］。鹽酸川芎嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine）是川芎中的主要活性生物堿。研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪有抗氧化應(yīng)激［4］、抗腫瘤［5］等作用。我們研究川芎嗪對(duì)多次UVA照射誘導(dǎo)HDF衰老以及MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)的影響，為其抗皮膚光老化提供一定的依據(jù)。

材料與方法

一、主要儀器和試劑

鹽酸川芎嗪（白色干粉劑，上海純優(yōu)生物科技有限公司，貨號(hào)P1010，CAS：76494-51-4，純度≥98%）CCK-8試劑盒、β半乳糖苷酶染色試劑盒（美國(guó)Sigma公司），Transcriptor First Strand cDNA合成試劑盒、2×SYBR Green I Master（ROX）（美國(guó)Roche公司）。UVA臺(tái)式紫外線治療儀（SS-04A）、UVA輻射探測(cè)儀（上海希格瑪高技術(shù)有限公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Life Technologies公司），PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Rotor-Gene 6000 PCR儀（美國(guó)Corbett公司）。

二、方法

1.藥物配制：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液常溫下溶解鹽酸川芎嗪，分別配制成濃度為20、50、100 mg/L。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：HDF為原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞，取自門(mén)診手術(shù)室健康青年男性（年齡18～23歲）包皮環(huán)切術(shù)后進(jìn)行標(biāo)本分離的包皮組織，采用酶消化法分離留取HDF進(jìn)行原代培養(yǎng)，連續(xù)傳代，取第3～10代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

3.細(xì)胞分組和UVA照射：部分HDF分成未給藥組（只給予含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液）、20 mg/L川芎嗪組、50 mg/L川芎嗪組、100 mg/L川芎嗪組，觀察川芎嗪預(yù)處理24、48、72 h對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性的影響。另一部分HDF分成5組：UVA＋20 mg/L川芎嗪組、UVA＋50 mg/L川芎嗪組、UVA＋100 mg/L川芎嗪組、UVA組（高糖DMEM培養(yǎng)液＋UVA照射）、未照射組（不照射，其余處置與UVA組同），各藥物組先用川芎嗪預(yù)處理HDF細(xì)胞24 h后進(jìn)行UVA照射，以觀察川芎嗪對(duì)多次UVA照射誘導(dǎo)HDF衰老以及MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)的影響。

UVA照射：HDF接種于直徑30 mm的培養(yǎng)皿中，接種密度為1×104/皿，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合時(shí)進(jìn)行UVA照射，利用UVA輻射探測(cè)儀檢測(cè)UVA的強(qiáng)度（照射強(qiáng)度10 mW/cm2，照射距離10 cm）調(diào)整照射時(shí)間使照射劑量為10 J，每日1次，連續(xù)照射5次，累積劑量為50 J。每次UVA照射前吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，再以PBS覆蓋細(xì)胞，置于冰上照射。

4.CCK-8法檢測(cè)川芎嗪對(duì)UVA照射前后HDF增殖活性的影響：取各組HDF，調(diào)整濃度為3.0× 103/ml接種于96孔板，每孔100 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑，置37℃培養(yǎng)箱中避光孵育2h，酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

5.光鏡下觀察HDF形態(tài)變化及β半乳糖苷酶染色：取各組細(xì)胞，多次UVA照射后24 h，光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，以衰老（傳至55代，P55）HDF作為衰老陽(yáng)性對(duì)照組。β半乳糖苷酶染色于光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況并拍照，藍(lán)色細(xì)胞為陽(yáng)性，每孔隨機(jī)挑選4個(gè)視野（×100）計(jì)數(shù)至少500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染色陽(yáng)性率［6］，每個(gè)視野染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HDF MMP-1、3的mRNA表達(dá)：取各組細(xì)胞，多次UVA照射后24 h提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。每次反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，采用△△Ct法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。目的基因引物：MMP-1上游：5′-CCCAAGGACATCTACAGC-3′，下游：5′-CTCTGGGATCAACGTCAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為630 bp；MMP-3上游：5′-TATGGATCCCC CCCTGACTCCCCTGAG-3′，下游：5′-ATGGAATTCA GGTTCAAGCTTCCTGAGG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為434 bp。β肌動(dòng)蛋白引物：上游5′-GTCCTCTCCCAA GTCCACAC-3′，下游：5′-GGGA-GACCAAAAGCCT TCAT-3′，擴(kuò)增片段205 bp。

結(jié)果

1.川芎嗪對(duì)HDF體外增殖活性的影響：見(jiàn)表1。與未加藥組比較，川芎嗪100 mg/L作用48 h組細(xì)胞增殖活性顯著降低（P＜0.05），而作用24 h和72 h組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)變化（均P＞0.05）。其余各濃度組的細(xì)胞增殖活性與未加藥組比較在各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。據(jù)此在后續(xù)非細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中選擇24 h作為處理時(shí)間。

表1 不同濃度川芎嗪作用不同時(shí)間對(duì)未照射人皮膚成纖維細(xì)胞體外增殖的影響（A450，±s）

表1 不同濃度川芎嗪作用不同時(shí)間對(duì)未照射人皮膚成纖維細(xì)胞體外增殖的影響（A450，±s）

注：n=3。a：與未加藥組比較，P＜0.05

分組 作用時(shí)間24 h 48 h 72 h未加藥組 0.343±0.035 0.616±0.077 0.890±0.046川芎嗪20 mg/L組 0.376±0.014 0.574±0.035 0.793±0.088川芎嗪50 mg/L組 0.365±0.029 0.627±0.034 0.809±0.069川芎嗪100 mg/L組 0.360±0.037 0.486±0.035a 0.860±0.049 F值 0.815 5.216 1.375 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＞0.05

2.川芎嗪對(duì)多次UVA照射后HDF體外增殖活性的影響：見(jiàn)表2。與未照射組比較，經(jīng)UVA多次照射后各組細(xì)胞增殖活性明顯降低，除48h時(shí)，UVA＋川芎嗪100mg/L組外，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與UVA組比較，川芎嗪各濃度組細(xì)胞增殖活性升高，且UVA＋川芎嗪100 mg/L組在24、48、72 h時(shí)與UVA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)果顯示，多次UVA照射對(duì)HDF的增殖活性有抑制作用，而川芎嗪在濃度100 mg/L范圍內(nèi)能減輕這種抑制作用，且在濃度100 mg/L時(shí)作用更顯著，在48 h時(shí)細(xì)胞增殖活性與未照射組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 川芎嗪對(duì)多次長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射后HDF體外增殖活性的影響（A450，±s）

表2 川芎嗪對(duì)多次長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射后HDF體外增殖活性的影響（A450，±s）

注：n=5。a：與未照射組比較，P＜0.05；b：與UVA組比較，P＜0.05。HDF：人皮膚成纖維細(xì)胞

作用時(shí)間24 h 48 h 72 h 0.522±0.037a 0.738±0.037a0.804±0.023a UVA＋川芎嗪20 mg/L組 0.566±0.046a 0.779±0.041a0.925±0.040ab UVA＋川芎嗪50 mg/L組 0.606±0.016ab 0.763±0.055a0.932±0.053ab UVA＋川芎嗪100 mg/L組 0.621±0.032ab 0.914±0.065b0.984±0.072ab未照射組 0.711±0.049b 0.894±0.020b 1.081±0.024b F值 17.451 15.231 23.535 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3.川芎嗪對(duì)多次UVA照射后HDF形態(tài)變化的影響：見(jiàn)圖1。未照射組細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，主要表現(xiàn)為細(xì)長(zhǎng)梭形、相互平行排列或呈放射狀和漩渦狀排列。P55組細(xì)胞有明顯老化現(xiàn)象，細(xì)胞體積變大、形狀扁平，或有過(guò)度伸展，伸展末端細(xì)長(zhǎng)有分枝，胞內(nèi)顆粒增加。UVA組細(xì)胞與P55組細(xì)胞有類似的變化，但程度較輕。而川芎嗪各濃度組細(xì)胞類似的變化則明顯減輕，且在100 mg/L時(shí)接近未照射組細(xì)胞形態(tài)。

4.HDFβ半乳糖苷酶染色情況：多次UVA照射后HDF β半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率明顯增加，其中UVA組β半乳糖苷酶陽(yáng)性率為（68.417±1.181）%，UVA＋川芎嗪20mg/L組為（58.167±5.620）%，UVA＋川芎嗪50mg/L組為（45.167±5.502）%，UVA＋川芎嗪100mg/L組為（43.000±2.000）%，未照射組為（33.667± 5.865）%，P55組為（76.000±6.557）%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.918，P＜0.01），且UVA組、UVA＋川芎嗪20 mg/L組、UVA＋川芎嗪50 mg/L組、UVA＋川芎嗪100mg/L組與未照射組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），UVA組細(xì)胞陽(yáng)性率接近P55組，且兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。川芎嗪能降低多次UVA照射引起的β半乳糖苷酶著色增加，其作用有隨濃度的增加而增大的趨勢(shì)，UVA＋川芎嗪20 mg/L組、UVA＋川芎嗪50mg/L組、UVA＋川芎嗪100 mg/L組與UVA組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 顯微鏡觀察川芎嗪對(duì)多次長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射后HDF形態(tài)變化的影響（×200） 未照射組（1A）細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)梭形；UVA＋川芎嗪100 mg/L組（1B）與未照射組細(xì)胞形態(tài)較接近，但細(xì)胞體積較未照射組有所增大；UVA組（1C）細(xì)胞生長(zhǎng)較稀疏，體積變大、形狀扁平、胞內(nèi)顆粒增加；P55組（1D）與UVA組細(xì)胞形態(tài)接近，細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏，體積變大、形狀扁平、伸展末端細(xì)長(zhǎng)有分支、胞內(nèi)顆粒增加

表3 川芎嗪對(duì)多次長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射后HDF MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)（2－△△C）t的影響（±s）

表3 川芎嗪對(duì)多次長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射后HDF MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)（2－△△C）t的影響（±s）

注：n=3。a：與未照射組比較，P＜0.05；b：與UVA組比較，P＜0.05。HDF：人皮膚成纖維細(xì)胞；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

分組 MMP-1 MMP-3 UVA組 7.430±1.544a 3.507±0.611a UVA＋川芎嗪20 mg/L組 3.123±1.040ab 2.130±0.191ab UVA＋川芎嗪50 mg/L組 1.503±0.388b 1.870±0.108ab UVA＋川芎嗪100 mg/L組 1.653±0.270b 1.190±0.030ab未照射組 1.000±0.000b 1.000±0.000b F值 29.151 267.029 P值 ＜0.01 ＜0.01

5.川芎嗪對(duì)多次UVA照射后HDF MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)的影響：見(jiàn)表3。與UVA組比較，不同濃度川芎嗪能降低衰老HDF中MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與未照射組比較，UVA組與川芎嗪20 mg/L組MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)量均顯著增加（均P＜0.05）。川芎嗪 50、100 mg/L濃度組 MMP-1的mRNA表達(dá)量與未照射組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），而MMP-3 mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

討論

川芎嗪是從中藥川芎中提取出來(lái)的活性生物單體，具有廣泛的藥理作用。本研究用川芎嗪作為研究對(duì)象，以多次低劑量UVA照射HDF誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，探討川芎嗪對(duì)UVA誘導(dǎo)HDF衰老的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，100 mg/L川芎嗪處理細(xì)胞48 h后出現(xiàn)短暫的細(xì)胞增殖抑制作用，可能與川芎嗪抑制成纖維細(xì)胞DNA合成有關(guān)［7］，但至72 h時(shí)抑制作用消失，提示其可能為一過(guò)性，細(xì)胞自身可對(duì)抗這種抑制作用。進(jìn)一步研究顯示，多次UVA照射可誘導(dǎo)HDF生長(zhǎng)緩慢，而川芎嗪在一定濃度范圍內(nèi)可減緩這種衰老現(xiàn)象，且在濃度為100 mg/L作用48 h后這種保護(hù)作用更強(qiáng)，該組細(xì)胞增殖活性與未照射組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與UVA照射前100 mg/L川芎嗪作用HDF 48 h出現(xiàn)一過(guò)性抑制作用相矛盾，我們推測(cè)這種矛盾可能與低濃度川芎嗪誘導(dǎo)HDF出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)有關(guān)。低劑量電離輻射可誘導(dǎo)生物體或細(xì)胞出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)已有較深入的研究并得到了證實(shí)［8］。普遍認(rèn)為適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)Ca2＋、蛋白激酶C（PKC）激活進(jìn)一步誘導(dǎo)保護(hù)性蛋白有關(guān)［9］。

衰老成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞均表達(dá)β半乳糖苷酶，而休眠細(xì)胞和終末分化細(xì)胞則缺乏。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能降低多次UVA照射引起HDF的β半乳糖苷酶表達(dá)，并改善細(xì)胞體積變大、顆粒增加等細(xì)胞衰老現(xiàn)象，提示川芎嗪能延緩多次UVA照射誘導(dǎo)的HDF衰老。

本課題組前期［10-11］研究表明，多次低劑量UVA能誘導(dǎo)HDF分泌MMP增加，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)皮膚光老化皺紋形成。有學(xué)者認(rèn)為，MMP-1和MMP-3在衰老的皮膚中表達(dá)增加，促進(jìn)皮膚光老化的發(fā)生［12］。研究表明，UVA的多次照射通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基累積等作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞衰老的發(fā)生，改變其生物學(xué)特性，增加MMP分泌，使膠原纖維及彈性纖維數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)崩解，從而引起皮膚干燥、深皺紋、粗糙、皮革樣外觀、色素沉著等皮膚光老化的改變［13］。本研究中，與UVA組比較，不同濃度川芎嗪均能降低多次UVA照射誘導(dǎo)的HDF內(nèi)MMP-1和MMP-3 mRNA表達(dá)。據(jù)此推測(cè)，川芎嗪有一定的抗皮膚光老化作用，可以通過(guò)降低HDF內(nèi)MMP-1和MMP-3 mRNA表達(dá)保護(hù)彈性纖維免遭水解，對(duì)抗皮膚老化。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)川芎嗪能延緩多次UVA照射引起的HDF生長(zhǎng)緩慢、細(xì)胞顆粒增加、體積變大以及β半乳糖苷酶表達(dá)增加等衰老現(xiàn)象，可能與川芎嗪清除氧自由基［4］甚至潛在地誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)有關(guān)，其機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

［1］呂瑩,蔣獻(xiàn).紫外線對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的影響［J］.國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志,2006,32（2）:130-132.

［2］Fagot D,Asselineau D,Bernerd F.Matrix metalloproteinase-1 production observed after solar-simulated radiation exposure is assumed by dermal fibroblasts but involves a paracrine activation through epidermal keratinocytes［J］.Photochem Photobiol,2004, 79（6）:499-505.

［3］Yao J,Liu Y,Wang X，et al.UVB radiation induces human lens epithelial cell migration via NADPH oxidase-mediated generation of reactive oxygen species and up-regulation of matrix metalloproteinases［J］.Int J Mol Med,2009,24（2）:153-159.

［4］Zheng CY,Xiao W,Zhu MX,et al.Inhibition of cyclooxygenase-2 by tetramethylpyrazine and its effects on A549 cell invasion and metastasis［J］.Int J Oncol,2012,40（6）:2029-2037.

［5］Zhang Y,Liu X,Zuo T,et al.Tetramethylpyrazine reverses multidrug resistance in breast cancer cells through regulating the expression and function of P-glycoprotein［J］.Med Oncol,2012,29（2）:534-538.

［6］Zhu Y,Song X,Han F,et al.Alteration of histone acetylation pattern during long-term serum-free culture conditions of human fetal placental mesenchymal stem cells［J/OL］.PLoS One,2015,10（2）:e0117068［2015-05-10］.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC4324636/

［7］江美芳.川芎嗪注射液的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2008,2（9）:109-110.

［8］Upton AC.National Coluncil on Radiation protection and measurements scientific committee 1-6.The state of the art in the 1990′s: NCRP Report No.136 on the scientific bases for linearity in the dose-response relationship for ionizing radiation［J］.Health Phys, 2003,85（1）:15-22.

［9］劉樹(shù)錚.低水平環(huán)境因子與適應(yīng)性反應(yīng)［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,1998,18（5）:310-315.

［10］劉仲榮,劉榮卿,張國(guó)威,等.基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)在皮膚光老化皺紋形成中的作用［J］.中華皮膚科雜志,2003,36（6）:332-334.

［11］劉靜宇,劉仲榮,楊慧蘭,等.低劑量長(zhǎng)波紫外線反復(fù)照射誘導(dǎo)培養(yǎng)成纖維細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2010,19（11）:1635-1637.

［12］Permatasari F,Hu YY,Zhang JA,et al.Anti-photoaging potential of Botulinum Toxin Type A in UVB-induced premature senescence of human dermal fibroblastsin vitrothrough decreasing senescencerelated proteins［J］.J Photochem Photobiol B,2014,133:115-123.

［13］Bae JT,Ko HJ,Kim GB,et al.Protective effects of fermented Citrus unshiu peel extract against ultraviolet-A-induced photoageing in human dermal fibrobolasts［J］.Phytother Res,2012,26（12）: 1851-1856.

Inhibitory effect of tetramethylpyrazine on ultraviolet A-induced senescence and matrix metalloproteinase-1 and-3 mRNA expressions in human dermal fibroblasts

Zhao Minling,Liu Zhongrong,Chen Hulin,Zhu Yingjie, Yan Miaomiao,Fan Xiuzhen.Department of Dermatology,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guangzhou 510010,China
Corresponding author:Liu Zhongrong,Email:pfklzr@163.com

ObjectiveTo explore the inhibitory effect of tetramethylpyrazine（TMP）on ultraviolet A-induced senescence as well as matrix metalloproteinase-1（MMP-1）and-3（MMP-3）mRNA expressions in human dermal fibroblasts（HDFs）.MethodsHDFs were isolated from the prepuce by enzymatic digestion,and subjected to primary culture.Cultured HDFs were randomly divided into several groups:control group cultured in high-glucose DMEM medium and receiving no treatment,three TMP groups treated with 20,50 and 100 mg/L TMP respectively,UVA group receiving UVA radiation alone,UVA＋TMP groups pretreated with 20,50 and 100 mg/L TMP respectively for different durations followed by UVA radiation.UVA radiation was given once daily for 5 consecutive days.The 55th passage HDFs served as the P55 group（senescence control group）.Subsequently,CCK-8 assay was performed to evaluate the proliferative activity of HDFsin vitro,optical microscopy to observe the morphologic changes of HDFs after UVA radiation,β-galactosidase staining to estimate the senescence in HDFs,and real-time fluorescence-based quantitative PCR to quantify the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-3 in HDFs.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance（ANOVA）followed by least significant difference（LSD）-ttest or Dunnett′s T3 test.ResultsCompared with the control group,the proliferation of HDFs was significantly but transiently inhibitedin vitroafter the treatment with 100 mg/L TMP for 48 hours（P＜0.05）,but showed no significant changes after the treatment with 20 or 50 mg/L TMP for 24,48 or 72 hours or after the treatment with 100 mg/L TMP for 24 or 72 hours（allP＜0.05）.The pretreatments with TMP of 20,50 and 100 mg/L for 24,48 and 72 hours all promoted the proliferation of HDFs to acertain degree in the UVA＋TMP groups compared with the UVA group,with significant differences in cellular proliferative activity among the UVA group,UVA＋TMP groups and control group at 24,48 and 72 hours（F=17.451, 15.231,23.535,allP＜0.01）.Compared with the UVA group,the proliferative activity of HDFs was significantly increased in UVA＋100-mg/L TMP group at 24,48,72 hours,UVA＋50-mg/L TMP group at 24 and 72 hours and UVA＋20-mg/L TMP group at 72 hours.After repetitive UVA radiation,HDFs in the UVA group experienced an increase in cell volume,granule acount,and β-galactosidase expression,which was similar to the changes in the P55 group,while the pretreatments with 20,50 and 100 mg/L TMP for 24 hours suppressed these UVA-induced changes in HDFs.The percentage of β-galactosidase-positive HDFs was 68.417%±1.181%in the UVA group,58.167% ±5.620%in the UVA＋20-mg/L TMP group,45.167%±5.502%in the UVA＋50-mg/L TMP group,43.000%±2.000%in the UVA＋100-mg/L TMP group,33.667% ±5.865%in the control group,and 76.000% ±6.557%in the P55 group,with significant differences among these groups（F=45.918,P＜0.01）.Furthermore,the UVA group significantly differed from the UVA＋TMP groups and control group in the percentage of β-galactosidase-positive HDFs and mRNA expressions of MMP-1 and MMP-3（allP＜0.05）.Conclusion TMP can protect HDFs against senescence induced by repetitive UVA radiation,and down-regulate the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-3 during senescence.

Tetramethylpyrazine;Fibroblasts;Cell aging;Matrix metalloproteinase 1;Matrix metalloproteinase 3;Ultraviolet rays;Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.009

國(guó)家自然科學(xué)基金（30972652）；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B021800053）

510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科

劉仲榮，Email：pfklzr@163.com

2014-11-21）

（本文編輯：尚淑賢）