王輝 林彤 王千秋

寬譜中波紫外線對(duì)人表皮黑素細(xì)胞非經(jīng)典Wnt通路的作用研究

王輝 林彤 王千秋

目的 探討寬譜中波紫外線（BB-UVB）照射對(duì)黑素細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑素含量的影響。方法 分別用0、10、20、30、40、50、100、200、300 mJ/cm2BB-UVB照射原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，采用CCK8法測(cè)定黑素細(xì)胞增殖率、多巴比色法測(cè)定酪氨酸酶活性、NaOH溶解法測(cè)定黑素含量。分別用0、30、50、100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)非經(jīng)典Wnt通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細(xì)胞，用Western印跡檢測(cè)作用前后非經(jīng)典Wnt通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，10～300 mJ/cm2BB-UVB照射后，細(xì)胞增殖率均逐漸降低，BB-UVB劑量＞100 mJ/cm2時(shí)細(xì)胞存活率＜50%，同時(shí)，10～100 mJ/cm2BB-UVB照射后酪氨酸酶活性逐漸增加，100 mJ/cm2BB-UVB組黑素含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。30、50、100 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1 mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組逐漸減少，JNK、MITF、RAC1、TYR的表達(dá)均較對(duì)照組逐漸升高，而30、50 mJ/cm2BB-UVB組WNT5A mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組降低，100 mJ/cm2BB-UVB組WNT5A mRNA表達(dá)量則明顯升高（P＜0.05）。100 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組降低，WNT5A、JNK、MITF、RAC1、TYR蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高（P＜0.05）。結(jié)論 紫外線照射降低黑素細(xì)胞增殖率，提高黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素含量。WIF-1基因可能抑制黑素生成。WIF-1基因表達(dá)降低可能通過(guò)非經(jīng)典通路Wnt蛋白的綜合作用激活JNK/MITF/TYR通路，最終促進(jìn)黑素合成。

黑素細(xì)胞；紫外線；Wnt信號(hào)通路；細(xì)胞增殖；黑素合成

Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路，主要由Wnt配體蛋白、細(xì)胞膜上受體、胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控等部分組成，與腫瘤、骨質(zhì)疏松、衰老、退化障礙等多種疾病有關(guān)［1］。經(jīng)典通路主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中β連環(huán)蛋白的水平調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞黑素合成與樹(shù)突形成［2］。非經(jīng)典通路也參與了黑素合成的調(diào)節(jié)，但其作用的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚［3］。波長(zhǎng)為275～320 nm的中波紫外線是紫外線生物學(xué)效應(yīng)最活躍的部分，促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、黑素生成及抑制變態(tài)反應(yīng)，但該作用產(chǎn)生的具體機(jī)制亦不清楚。我們用寬譜中波紫外線（BB-UVB）照射黑素細(xì)胞，觀察黑素細(xì)胞增殖、黑素合成變化及非經(jīng)典Wnt通路中黑素細(xì)胞黑素生成相關(guān)基因的表達(dá)，初步探討非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因在紫外線誘導(dǎo)的黑素生成中的作用。

資料與方法

一、主要試劑與儀器

Medium254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基、HMGS添加劑、左旋多巴（L-Dopa）、分離酶（Protease typeⅨ）（美國(guó)Sigma公司），完全1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胰蛋白酶（美國(guó)Amresco公司），CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Wnt5A/RAC1小鼠單克隆抗體、WIF-1/MITF/ JNK兔單克隆抗體、TYR兔多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），Tripure Isolation Reagent（瑞士Roche公司）。一步法RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。SS-04B型寬譜中波紫外線光療儀、BB-UVB輻照度監(jiān)視器（上海希格瑪高技術(shù)有限公司）。

二、黑素細(xì)胞原代培養(yǎng)

取小兒包皮環(huán)切術(shù)后標(biāo)本，新鮮培養(yǎng)基浸泡，送至實(shí)驗(yàn)室。碘伏浸泡10 min后用生理氯化鈉溶液沖洗3次。去除皮下組織，剪成10 mm×20 mm細(xì)條，置于0.5%分離酶中4℃過(guò)夜或37℃3～4 h。眼科鑷輕輕分離表真皮，表皮用生理氯化鈉溶液洗2次，置于0.1%胰酶與0.02%EDTA 1∶1混合液中37℃孵育10min，加入完全1640培養(yǎng)基中止消化，200目濾器過(guò)濾，收集過(guò)濾液置入離心管內(nèi)300×g離心10 min，棄上清后重懸，以106個(gè)/ml細(xì)胞種入25 cm2無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育，差速黏附法獲取純化的黑素細(xì)胞［4］。每2～3天換液，取第2～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

三、黑素細(xì)胞活力測(cè)定

采用CCK8法，用胰酶將步驟1中細(xì)胞消化下來(lái)，96孔板中，每個(gè)孔種5 000個(gè)細(xì)胞。種板第2天去除培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS洗1次，分別用10、20、30、40、50、100、200、300 mJ/cm2BB-UVB照射，以未接受BB-UVB照射為對(duì)照組。照射光源采用SS-04B型寬譜中波紫外線光療儀，細(xì)胞距紫外光源15 cm，用BB-UVB輻照度監(jiān)示器標(biāo)定輻照度，UVB劑量=UVB輻照度［mJ/（cm2·s）］×?xí)r間（s）。BB-UVB照射后每個(gè)孔加入培養(yǎng)基100 μl，培養(yǎng)48 h后，每個(gè)孔加入CCK8溶液10 μl，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2 h后，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值。細(xì)胞增殖率（%）=［（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-空白對(duì)照吸光度值）］×100%。

四、多巴比色法檢測(cè)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性、NaOH溶解法測(cè)定黑素含量

將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，去除培養(yǎng)基，用已在37℃水浴鍋中預(yù)熱過(guò)的PBS洗1次，去除PBS，分別用10、20、30、40、50、100、200、300 mJ/cm2BB-UVB照射，時(shí)間分別為7 s、14 s、21 s、28 s、35 s、70 s、140 s、210 s。以未接受BB-UVB照射的細(xì)胞為對(duì)照組。BB-UVB處理后，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后用胰酶消化細(xì)胞，加入培養(yǎng)基和胰酶后，將細(xì)胞均勻轉(zhuǎn)移至微量離心管中，300×g、4℃離心5 min。離心后去除培養(yǎng)基，用PBS洗2次，離心去上清液備用。

將上述細(xì)胞加入到200 μl的0.1%Triton-X100中重懸，放在冰上將細(xì)胞裂解30 min，將裂解液一分為二，其中一個(gè)加入等體積的1 g/L L-Dopa 37℃反應(yīng)4 h，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值；另一部分裂解液，4℃、3 600×g離心10 min，對(duì)于上清液采用BCA試劑盒做蛋白定量，而沉淀則用1 mol/L NaOH重懸，50℃反應(yīng)1 h，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值。各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組測(cè)得吸光度值后分別除以上清液蛋白含量為平均吸光度值。細(xì)胞酪氨酸酶活性（或細(xì)胞黑素含量）（%）=［（實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值-空白對(duì)照組吸光度）/（對(duì)照組平均吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值）］×100%。

五、實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)非經(jīng)典Wnt通路中黑素細(xì)胞黑素生成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，去除培養(yǎng)基，用已在37℃水浴鍋中預(yù)熱過(guò)的PBS洗1次，去除PBS，分別用30、50、100mJ/cm2BB-UVB照射，以未接受BB-UVB照射的細(xì)胞為對(duì)照組。BB-UVB處理后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后吸去培養(yǎng)基，按照Tripure總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA。分別設(shè)計(jì)各目的基因的特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核苷酸（cDNA），按qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增目的條帶。采用Thermal cycler軟件包計(jì)算Ct值，分析熒光強(qiáng)度。mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct表示。

表1 實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增引物序列

六、Western印跡測(cè)定黑素細(xì)胞蛋白表達(dá)

將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，去除培養(yǎng)基，用已在37℃水浴鍋中預(yù)熱過(guò)的PBS洗1次，去除PBS，用100 mJ/cm2BBUVB照射，以未接受BB-UVB照射的細(xì)胞為對(duì)照組。BB-UVB處理后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后吸去培養(yǎng)基，按細(xì)胞全蛋白提取試劑盒方法提取細(xì)胞總蛋白，蛋白樣品加熱變性后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、與一抗、二抗孵育，ECL發(fā)光法壓片顯色。采用Quantity One灰度分析軟件對(duì)所得條帶進(jìn)行灰度分析，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參條帶的比值計(jì)算相對(duì)灰度值。

七、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果

一、不同劑量BB-UVB照射對(duì)黑素細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素含量的影響

10、20、30、40、50、100、200、300 mJ/cm2BB-UVB照射原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10～300 mJ/cm2BB-UVB組細(xì)胞增殖率均降低，10～100 mJ/cm2BB-UVB組酪氨酸酶活性均增加，100 mJ/cm2BB-UVB組黑素含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。當(dāng)BB-UVB劑量＞100 mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞的增殖率已＜50%，培養(yǎng)皿中的黑素細(xì)胞大量漂浮、死亡，存活細(xì)胞很少，如此時(shí)再檢測(cè)酪氨酸酶活性和黑素含量誤差較大，遂未再檢測(cè)200 mJ/cm2、300 mJ/cm2時(shí)酪氨酸酶活性和黑素的生成量。見(jiàn)表2。

表2 不同劑量BB-UVB照射后黑素細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑素含量（±s）

表2 不同劑量BB-UVB照射后黑素細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑素含量（±s）

注：n=3。與對(duì)照組比較，a：P＜0.05，b：P＜0.01

BB-UVB劑量（mJ/cm2）檢測(cè)指標(biāo)（%）細(xì)胞增殖率 酪氨酸酶活性 黑素含量對(duì)照組 100.00±8.23 100.00±6.04 100.00±4.24 10 74.64±4.87a 114.92±10.76b 93.26±5.33 20 69.78±6.73a 114.22±6.36b 99.38±5.66 30 66.67±4.33a 121.1±5.21a 94.55±4.44 40 62.10±1.90a 125.85±4.84a 96.17±3.17 50 57.87±2.95a 130.41±8.73a 113.35±9.57 100 51.51±2.41a 175.36±5.27a 185.19±18.38a 200 33.62±3.02a - -300 22.20±0.22a - -F值 67.93 34.46 42.77 P值 0.00 0.00 0.00

二、不同劑量BB-UVB照射后Wnt非經(jīng)典通路基因mRNA表達(dá)的變化

不同劑量BB-UVB照射后，各組WIF-1、WNT5A、JNK、MITF、RAC1、TYR mRNA表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為 150.44、322.67、130.70、259.57、310.11、40.35，均P＜0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示，30、50、100 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1 mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組降低，JNK、MITF、RAC1、TYR mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而30、50 mJ/cm2BB-UVB照射后WNT5A mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組降低，100 mJ/cm2BB-UVB照射后WNT5A mRNA表達(dá)量較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同劑量BB-UVB照射后非經(jīng)典通路各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量 1A～1F：分別為不同劑量BB-UVB照射后WIF-1、WNT5A、JNK、MITF、RAC1、TYR mRNA相對(duì)表達(dá)量

三、100 mJ/cm2BB-UVB照射后Wnt非經(jīng)典通路基因蛋白表達(dá)變化

100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細(xì)胞后，48 h測(cè)定各組基因蛋白水平的表達(dá)變化。將對(duì)照組蛋白表達(dá)量設(shè)為1，各基因100 mJ/cm2BB-UVB照射組蛋白表達(dá)水平如圖2所示。

圖2 100 mJ/cm2BB-UVB照射后Wnt非經(jīng)典通路基因蛋白電泳圖

圖3 100 mJ/cm2BB-UVB照射前后黑素細(xì)胞樹(shù)突變化（倒置顯微鏡，×100） 紫外線照射前原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，生長(zhǎng)較密集，樹(shù)突以2～3個(gè)為主

圖4 100 mJ/cm2紫外線照射后48 h，黑素細(xì)胞數(shù)目減少，體積增大，樹(shù)突明顯增多

四、100 mJ/cm2BB-UVB照射后細(xì)胞樹(shù)突變化

如圖3所示，紫外線照射前黑素細(xì)胞生長(zhǎng)較密集，樹(shù)突以2～3個(gè)為主。100mJ/cm2BB-UVB照射后48h黑素細(xì)胞數(shù)目減少，體積增大，樹(shù)突明顯增多，見(jiàn)圖4。

討論

本研究中黑素細(xì)胞經(jīng)不同劑量BB-UVB照射后，隨著照射劑量的升高，細(xì)胞增殖率明顯降低，可能與黑素細(xì)胞在UVB照射后可生成嘧啶二聚體及活性氧類(lèi)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡有關(guān)。有研究［5］檢測(cè)1.25、2.5、5、10、25、50、100 mJ/cm2BB-UVB作用后黑素細(xì)胞的活力變化發(fā)現(xiàn)，小劑量（1.25 mJ/cm2）BB-UVB照射后細(xì)胞少量增殖，2.5 mJ/cm2以上BB-UVB照射后細(xì)胞活力開(kāi)始降低，25 mJ/cm2BB-UVB照射后細(xì)胞活力為對(duì)照組的60%。不同研究所得毒性劑量的不同，可能與細(xì)胞活力測(cè)定方法不同、原代細(xì)胞來(lái)源個(gè)體差異、紫外線照射方式（UVB照射間隔時(shí)間）不同有關(guān)。本研究顯示，＜100 mJ/cm2BB-UVB照射后，細(xì)胞存活率在50%以上，100 mJ/cm2BBUVB照射后黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性增加，黑素細(xì)胞黑素含量較對(duì)照明顯增加，所以我們選用30、50、100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細(xì)胞，觀察目的基因mRNA的變化，同時(shí)選擇該范圍內(nèi)酪氨酸酶活性和黑素含量升高最明顯的BB-UVB劑量，即采用100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細(xì)胞后檢測(cè)目的基因蛋白含量的變化。

WIF-1屬于分泌型卷曲相關(guān)蛋白（sFRP）家族，通過(guò)直接與Wnt分子結(jié)合，抑制Wnt信號(hào)的經(jīng)典和非經(jīng)典途徑。Kim等［6］發(fā)現(xiàn)黃褐斑皮損WIF-1的表達(dá)明顯降低，將WIF-1基因沉默后，酪氨酸酶的表達(dá)升高，黑素小體生成增多，推測(cè)WIF-1可能抑制了黑素的生成。Park等［7］對(duì)黃褐斑患者皮損區(qū)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)皮損區(qū)WIF-1的表達(dá)升高，WIF-1可能促進(jìn)黑素合成。本研究用30 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1的mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，TYR基因mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，隨著紫外線劑量升高，WIF-1的mRNA表達(dá)降低，TYR基因mRNA表達(dá)逐漸升高。在蛋白水平上，100 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1蛋白生成量小于對(duì)照組，TYR蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組，所以正常狀態(tài)下WIF-1基因產(chǎn)物可能通過(guò)對(duì)經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑的綜合作用對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶基因有抑制作用，進(jìn)而抑制黑素的生成，紫外線照射后抑制作用降低，黑素合成增多。

WNT5A是非經(jīng)典通路重要的胞外調(diào)控因子。Zhang等［8］研究認(rèn)為，WNT5A不僅能抑制黑素細(xì)胞的增殖，還能通過(guò)下調(diào)色素形成相關(guān)基因的表達(dá)減少黑色素的合成，且這種作用是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)JNK的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。而在Park等［7］的研究中，黃褐斑皮損中WNT5A的表達(dá)也是上調(diào)的。本研究中30、50 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細(xì)胞后，WNT5A mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組，而在BB-UVB劑量上升至100 mJ/cm2時(shí)，WNT5A的mRNA及蛋白的表達(dá)量均明顯升高，與下游JNK及MITF、TYR等基因的表達(dá)趨勢(shì)不一致。推測(cè)原因可能有以下兩點(diǎn)：①WNT5A對(duì)下游基因的調(diào)控可能以綜合作用為主，也就是說(shuō)該基因?qū)ο掠位虻恼{(diào)控可能不是單向的，而是通過(guò)對(duì)下游數(shù)個(gè)通路如Ca2+通路、JNK通路甚至經(jīng)典通路的綜合作用實(shí)現(xiàn)的［9］；②JNK的表達(dá)也受上游多個(gè)非經(jīng)典通路因子的綜合作用。低劑量紫外線照射可能以Wnt非經(jīng)典通路的其他基因?qū)NK的調(diào)控作用為主，當(dāng)BB-UVB的劑量增大至100 mJ/cm2時(shí)，WNT5A對(duì)JNK/MITF/TYR通路發(fā)揮促進(jìn)作用。

Rho家族小GTP酶尤其是RHOA，RAC1和CDC42在黑素細(xì)胞細(xì)胞骨架和樹(shù)突形成方面起重要作用［10］。RAC1可以增強(qiáng)c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸激酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞板狀偽足的形成，使黑素細(xì)胞樹(shù)突增多［11-12］。本研究結(jié)果顯示，隨紫外線劑量的升高，RAC1基因的mRNA表達(dá)增多，100 mJ/cm2BB-UVB照射后蛋白的表達(dá)同步升高。在圖3中可以看到，100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活量較前減少，但存活細(xì)胞的樹(shù)突明顯增多，說(shuō)明RAC1基因參與了黑素細(xì)胞樹(shù)突形成的調(diào)控，RAC1基因的表達(dá)增多促進(jìn)黑素細(xì)胞樹(shù)突增多，因此，在紫外線照射黑素細(xì)胞后，黑素細(xì)胞黑素生成能力增加的同時(shí)黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)能力甚至黏附功能同步提高。

MITF作為黑素細(xì)胞黑素生成最重要的轉(zhuǎn)錄因子，一方面可以誘導(dǎo)酪氨酸酶基因家族在黑素細(xì)胞中的特異性表達(dá)，另一方面參與外界刺激對(duì)黑素細(xì)胞黑素生成的調(diào)控。MITF調(diào)控酪氨酸酶相關(guān)蛋白家族的表達(dá)，而TYR的表達(dá)和活性決定著黑素生成的速度和產(chǎn)量，是影響黑素生成最核心的調(diào)節(jié)酶。本實(shí)驗(yàn)中隨著B(niǎo)B-UVB劑量的增加，JNK、MITF、TYR的mRNA表達(dá)逐漸增多，且Western印跡顯示，100mJ/cm2BB-UVB照射后，JNK、MITF、TYR蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組，提示上游通路的各因子可能通過(guò)激活JNK/MITF/TYR通路最終促進(jìn)酪氨酸酶的表達(dá)及黑素生成。

［1］Maruotti N,Corrado A,Neve A,et al.Systemic effects of Wnt signaling［J］.J Cell Physiol,2013,228（7）:1428-1432.

［2］王輝,王千秋,林彤.Wnt通路及抑制因子對(duì)黑素細(xì)胞調(diào)控作用的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志,2015,41（2）:125-128.

［3］LimX,NusseR.Wntsignalinginskindevelopment,homeostasis,and disease［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5（2）:a008029.

［4］趙志國(guó),丁克云,金城,等.人表皮成黑素細(xì)胞培養(yǎng)條件的初步探討［J］.中華皮膚科雜志,2009,42（1）:49-51.

［5］Cho TH,Lee JW,Lee MH.Evaluating the cytotoxic doses of narrowband and broadband UVB in human keratinocytes, melanocytes,and fibroblasts［J］.Photodermatol Photoimmunol Photomed,2008,24（3）:110-114.

［6］Kim JY,Lee TR,Lee AY.Reduced WIF-1 expression stimulates skin hyperpigmentation in patients with melasma［J］.J Invest Dermatol,2013,133（1）:191-200.

［7］Park TJ,Kim M,Kim H,et al.Wnt inhibitory factor（WIF）-1 promotes melanogenesis in normal human melanocytes［J］.Pigment Cell Melanoma Res,2014,27（1）:72-81.

［8］Zhang J,Li Y,Wu Y,et al.Wnt5a inhibits the proliferation and melanogenesis of melanocytes［J］.Int J Med Sci,2013,10（6）: 699-706.

［9］Topol L,Jiang X,Choi H,et al.Wnt-5a inhibits the canonical Wnt pathway by promoting GSK-3-independent beta-catenin degradation［J］.J Cell Biol,2003,162（5）:899-908.

［10］Jackson TA,Koterwas DM,Morgan MA,et al.Fibroblast growth factors regulate prolactin transcription via an atypical Racdependent signaling pathway［J］.Mol Endocrinol,2003,17（10）: 1921-1930.

［11］Yamauchi J,Miyamoto Y,Sanbe A,et al.JNK phosphorylation of paxillin,acting through the Rac1 and Cdc42 signaling cascade, mediates neurite extension in N1E-115 cells［J］.Exp Cell Res, 2006,312（15）:2954-2961.

［12］Sigal YJ,Quintero OA,Cheney RE,et al.Cdc42 and ARP2/3-independent regulation of filopodia by an integral membrane lipidphosphatase-relatedprotein［J］.JCellSci,2007,120（Pt2）:340-352.

Effects of broadband ultraviolet B on non-canonical Wnt pathways in human epidermal melanocytes

Wang Hui, Lin Tong,Wang Qianqiu.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China
< class="emphasis_italic">Corresponding authors:Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com;Wang Qianqiu,Email:wangqq@ncstdlc.org

s:Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com;Wang Qianqiu,Email:wangqq@ncstdlc.org

ObjectiveTo investigate the effects of broadband ultraviolet B（BB-UVB）on the proliferation of, tyrosinase activity and melanogenesis in melanocytes.MethodsMelanocytes isolated from human foreskin were subjected to primary culture.Some cultured primary melanocytes were irradiated with BB-UVB at 10,20,30,40,50,100, 200 and 300 mJ/cm2.Then,CCK-8 assay was performed to evaluate the proliferative activity of melanocytes,dopa oxidation assay to estimate the activity of tyrosinase,and sodium hydroxide（NaOH）-lysis method was used to determine melanin content.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was conducted to measure the mRNA expressions of genes involved in non-canonical Wnt pathways in melanocytes after irradiation with BB-UVB at 30,50 and 100 mJ/cm2. Western blot was carried out to determine the expressions of proteins involved in non-canonical Wnt pathways in melanocytes before and after irradiation with BB-UVB of 100 mJ/cm2.The melanocytes receiving no treatment served as the control group.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance followed by least significant difference（LSD）-ttest for multiple group comparisons and by the independent samplettest for two-group comparisons.ResultsAfter irradiation with BB-UVB at 10－300 mJ/cm2,the proliferative activity of melanocytes was gradually reduced compared with the control group（allP＜0.05）,and the survival rate of melanocytes was less than 50%when the irradiation dose of BB-UVB was higher than 100 mJ/cm2.Furthermore,tyrosinase activity gradually increased in melanocytes after irradiation with BB-UVB at 10-100 mJ/cm2compared with the control group,and the increase was statistically significant at the radiation dose of 100 mJ/cm2（P＜0.05）.Compared with the control group,the WIF-1 mRNA expression level decreased,while c-Jun N-terminal kinase（JNK）,microphthalmia-associated transcription factor（MITF）,Ras-related C3 botulinum toxin substrate1（RAC1）and tyrosinase（TYR）mRNA expression levels increased in melanocytes after irradiation with BB-UVB at 30,50 and 100 mJ/cm2（allP＜0.05）;the WNT5A mRNA expression significantly decreased in melanocytes irradiated with 30 and 50 mJ/cm2BB-UVB,but increased in those irradiated with 100 mJ/cm2BB-UVB（allP＜0.05）.The radiation with 100 mJ/cm2BB-UVB significantly decreased the expression ofWIF-1 protein,but enhanced the expressions of WNT5A,JNK,MITF,RAC1 and TYR proteins in melanocytes compared with the control group（allP＜0.05）.ConclusionsBB-UVB can decelerate the proliferation of,elevate tyrosinase activity and melanin level in,melanocytes.The WIF-1 gene may inhibit melanogenesis,and the decrease in its expression may promote melanogenesis by activating the JNK/MITF/TYR pathway through the combined effects of proteins involved in non-canonical Wnt pathways.

Melanocytes;Ultraviolet rays;Wnt signaling pathway;Cell proliferation;Melanin synthesis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.007

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012507）

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

林彤，Email：ddlin@hotmail.com；王千秋，Email：wangqq@ncstdlc.org

2015-04-27）

（本文編輯：吳曉初）