張中華楊愛梅

（甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部1 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院2 甘肅 蘭州 730050）

響應(yīng)面法優(yōu)化沙米總黃酮提取工藝的研究

張中華1，2楊愛梅2

（甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部1 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院2 甘肅 蘭州 730050）

目的：采用雙水相法萃取沙米中總黃酮，通過響應(yīng)面法優(yōu)化獲得最佳萃取工藝條件。方法：采用無水乙醇（C2H5OH）/硫酸銨（（NH4）2SO4）雙水相體系分離沙米中的黃酮，通過單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探討黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值對萃取效果的影響。結(jié)果：最佳萃取條件為：黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.88%、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、pH8，在此條件下，沙米中總黃酮主要分布在上相，萃取率可達(dá)到91.29%。結(jié)論：在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)論與理論值基本吻合，表明該模型合理有效。

響應(yīng)面法；雙水相體系；沙米；總黃酮

沙米（Agtiopllyllum squarrosum） 屬黎科沙蓬屬的種子，又稱沙蓬，主要分布于中國東北、華北、西北及河南等地區(qū)，是一種耐寒、耐旱的沙生植物。作為沙漠野生植物，安全、營養(yǎng)、無污染，中醫(yī)中稱之為天然減肥食品和心腦血管、腎臟功能減退、糖尿病人的理想食品［1］，故沙米是一種“藥食同源”的綠色食品。而其中有一種重要營養(yǎng)成分黃酮。沙米中黃酮分子量小，能被人體吸收，能通過血腦屏障，能進(jìn)入脂肪組織，進(jìn)而體現(xiàn)出如下功能：消?；钅X、抗脂肪氧化、抗衰老、保護(hù)血管、防動脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)管疏通微循環(huán)的功能。黃酮類化合物還具有抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等作用［2］。因此，越來越多的植物黃酮被開發(fā)并應(yīng)用到食品添加劑、醫(yī)藥以及化妝品等行業(yè)［3］。

本試驗(yàn)采用C2H5OH/（NH4）2SO4雙水相體系萃取沙米中的黃酮。分別考察了C2H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)，pH對沙米黃酮萃取率的影響，對影響萃取率的三因素進(jìn)行Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)，獲取最佳萃取條件。目前沙米黃酮提取尚未見報(bào)道，如果能夠?qū)ζ浼右蚤_發(fā)利用，可以充分利用沙漠野生資源。本實(shí)驗(yàn)對沙米總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，以便為更好地開發(fā)利用野生沙米資源提供可靠依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料與試劑

沙米（粉末），C2H5OH、（NH4）2SO4、氯化鈉均為分析純。722型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司制造）；超聲波微波組合系統(tǒng)（南京先歐儀器制造有限公司）；電子天平（梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司）；超級恒溫水浴（揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司）；循環(huán)水真空泵（鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗提液制備

稱取沙米6.0g，溶于60mL50%C2H5OH中，超聲輔助提取10min，抽濾，得粗提液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

本文采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系絡(luò)合化學(xué)吸光法［4］測定黃酮含量，510nm處測定吸光值。利用陳陽等方法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=1.2450X-0.0024（R2=0.99920）。

1.2.3 雙水相萃取方法

稱取一定量的C2H5OH、（NH4）2SO4和粗提液，使總體系達(dá)到10.0g，溶解混合，在一定條件下靜置形成雙水相體系，所得體系總黃酮富集于上相，下相為（NH4）2SO4相。待萃取完成后，準(zhǔn)確測定上、下相體積，求萃取率。相比R=Vt/Vb；

分配系數(shù)K=Ct/Cb；萃取率Y%=KR/（KR+1）×100%（Vt為上相體積/ml；Vb為下相體積/ml；Ct為上相黃酮濃度/（mg/ml）；Cb 為下相黃酮濃度/（mg/ml））。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

分別取不同的C2H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值測其黃酮含量，以選擇最佳的各單因素取值范圍。

1.2.5 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，以粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值為影響因素，進(jìn)行Box-Benhnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以選擇最佳提取工藝條件并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.1 確定雙水相體系

2.1.1 C2H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響

在雙水相體系中，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%，改變C2H5OH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，當(dāng)C2H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%時，沙米黃酮提取率最大83.2%。當(dāng)C2H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過27%時，兩相體系出現(xiàn)（NH4）2SO4不能完全溶解的現(xiàn)象。說明最佳C2H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%。

2.1.2 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響

在雙水相體系中，取C2H5OH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%，改變（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2。

由圖2可知，在（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于14%時溶劑體系不成相，這主要是因?yàn)椋∟H4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低時鹽析效果不明顯。當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%時，沙米黃酮的萃取率最大87.2%，而隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其萃取率逐漸減少，原因當(dāng)（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時，鹽析作用過強(qiáng)，另外（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，乙醇相體積會減少，相比降低，黃酮將被部分析出［5］。故22%-24%（NH4）2SO4時有部分不溶解沉淀沉在底層。因此（NH4）2SO4的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%。

2.2 單因素的確定

2.2.1 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取效果的影響

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4雙水相體系中，改變粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)。室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3。由圖3可知，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時，其沙米總黃酮萃取率達(dá)85.6%。隨著粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)增加，粗提液體積大，粗提液在濃縮時體積的增大，濃縮時間變長而部分被氧化，使沙米總黃酮萃取率逐漸減小。而粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)太小，提取不完全［6］。因此最佳粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

圖1 C2H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響

圖2 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響

2.2.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取效果的影響

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4雙水相體系中，12%粗提液下加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl，室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4。由圖4可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，其萃取率最大77%，原因是加入少量無機(jī)鹽時，由于無機(jī)鹽的正負(fù)離子在兩相系統(tǒng)中分配不同，將在兩相間產(chǎn)生電位差，兩相間電位差的變化，縮短了分相時間，提高了相分離速度［7］，沙米黃酮在上相的分配增加，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)加大，其萃取率減小，因?yàn)檩腿∠嗟臉O性增強(qiáng)，使沙米黃酮的溶解度下降，而出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象［7］。因此，最佳NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇1.5%。

2.2.3 pH值對沙米黃酮萃取效果的影響

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4雙水相體系中，加入1.5%的NaCl后，再加入12%的粗提液，改變pH值。室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5。由圖5可知，當(dāng)pH值為7時，沙米黃酮萃取率達(dá)到最大；pH＞7時，隨著pH值的增大萃取率減小，因pH＞7，使黃酮雜環(huán)鏈裂解，導(dǎo)致萃取率降低。因此最佳體系pH值選擇中性。

圖3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取效果的影響

圖4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對沙米黃酮萃取效果的影響

圖5 pH值對沙米黃酮萃取效果的影響

由圖5可知，在當(dāng)pH＜7時，沙米黃酮萃取率隨著pH值的增大而增大；當(dāng)pH值為7時，沙米黃酮萃取率達(dá)到最大；當(dāng)pH＞7時，隨著pH值的增大萃取率減小，是因?yàn)楫?dāng)pH＞7時，使黃酮雜環(huán)鏈裂解，導(dǎo)致萃取率降低。因此選擇pH7。

2.3 曲面響應(yīng)法對提取沙米黃酮工藝的優(yōu)化結(jié)果分析

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4雙水相萃取體系中影響萃取率的3個因素（粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值）為考察對象，按表1進(jìn)行3因素17水平優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以提取率為指標(biāo)，考察綜合因素對提取率的影響，選擇最佳沙米總黃酮提取工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平Table1 The factors and level of response surface design

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值表(N=17)Table2 Box-Benhnken experimental design and response value (N=17)

2.3.1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

以萃取率為響應(yīng)值，根據(jù)表2結(jié)果，用Design-Expert8.6.0軟件進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果如表3。經(jīng)回歸擬合后得到的回歸方程為：Y=52.44-0.525A+6.7625B+1.9375C+3.525AB+3.975AC-0.6BC+1.105A2+20.48B2+5.73C2（A、B、C分別代表粗提液、pH、NaCl的編碼值）。

表3 響應(yīng)面方差分析Table3 response surface analysis of variance

由表3可知，模型Pr＞F值小于0.0500，說明該模型是極顯著的；B、B2影響極顯著，C2影響顯著，其余項(xiàng)影響不顯著［11］。模型失擬項(xiàng)＞F值為0.606，說明回歸方程具有很好的擬合度。同時，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.949256，表明94.9256%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋［8］。變異系數(shù)（C.V）反映模型的置信度，C.V值越低模型的置信度越高，本實(shí)驗(yàn)的C.V值為6.69445%，說明模型方程可以很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值，因此，我們可以用該模型來分析響應(yīng)值的變化［9］。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過Design-Expert8.6.0軟件繪制響應(yīng)面曲線圖來進(jìn)行分析，見圖6。通過軟件分析計(jì)算，得到沙米黃酮萃取率最大時的工藝條件為：A=0.94，B=0.96，C=1.00，即粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.88%，pH值為8，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，此時萃取率預(yù)測值為92.5033%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果沙米黃酮的萃取率為91.29%，與理論值基本吻合，表明該模型合理有效。

圖6 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取率交互作用的等高線圖Fig.6 crude extract concentration, pH value, NaCl concentration on the extraction rate of the interaction of contour maps

3、討論

雙水相萃取與傳統(tǒng)方法相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：不存在有機(jī)溶劑殘留、分相時間短、萃取周期短易于生產(chǎn)、能除去大量雜質(zhì)和固體物質(zhì)、易于工程放大和連續(xù)操作等，被廣泛應(yīng)用于生物化工、天然活性產(chǎn)物等領(lǐng)域［10］。國內(nèi)外有將該體系用于天然活性成分的研究，但側(cè)重于如何提高目標(biāo)產(chǎn)物萃取率，忽略了目標(biāo)成分與雜質(zhì)的分離問題，若經(jīng)離心分相，方能得到界面清晰的雙水相體系，從而萃取過程中不易發(fā)生乳化，能更好地除去不溶性雜質(zhì)。針對這一情況，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用C2H5OH/（NH4）2SO4體系，在保證分離效果的前提下，系統(tǒng)地考察了該體系對沙米黃酮的萃取條件，而且使沙米中黃酮與樣品溶液中其他物質(zhì)得到有效分離。本研究為黃酮的萃取分離提供了一種有效方法，旨在為沙米黃酮的分離純化和開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

[1]任文明,劉雪峰,倪春梅.毛烏素沙漠天然沙米營養(yǎng)成分的分析.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2005,26(2):88-90

[2]許麗旋,蔡建秀.竹筍殼黃酮粗提液抑菌效果的初步研究.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊 2006,(7):63- 65

[3]郭芳彬.蜂產(chǎn)品中黃酮的保健作用.養(yǎng)蜂科技 2005, (2):28- 31

[4]陳陽,王軍華,陳亞光等.紅花蕓豆色素的提取及穩(wěn)定性研究.食品科學(xué) 2007,28(6): 175-179

[5]謝云飛,常雅寧,謝志鐳等.用雙水相體系分離血紅蛋白.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào) 2010,36(5):685-689

[6]王順民,季長路,任晶晶.超聲波協(xié)同雙水相體系提取芫荽總黃酮的研究.安徽工程科技學(xué)院學(xué)報(bào)2009,24(3):23-24

[7]王倩,賈長虹,常麗新等.雙水相萃取法分離純化狗棗獼猴桃葉總黃酮.食品科學(xué) 2011,32(16):167-171

[8]趙立輝,武文潔,楊昱涵.雙水相系統(tǒng)純化山楂葉中黃酮類物質(zhì)的研究.天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2009,(05)

[9]楊實(shí)權(quán),張喜成,劉軍鋒等.響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母產(chǎn)油脂條件.微生物學(xué)通報(bào) 2010,37(1):91-95

[10]洪鯤,乙引,張豪等.響應(yīng)面法優(yōu)化固相化脂酶Lipozyme TL IM催化菜籽油水解過程.中國油脂2011,36(9):39-42

Optimization of extraction technology of total fl avonoids from Agtiopllyllum squarrosum using response surface analysis

ZHANG Zhong-hua1YANG Ai-mei2
The phamaceutical department of Gansu provincial hospital of Traditional Chinese Medicine， College of Life Science and Engineering， Lanzhou University of Technology Lanzhou，730050，Gansu，China；

Abstrect:Objective: Optimization of extraction technology of total flavonoids from Agtiopllyllum squarrosum using response surface analysis.Method:An aqueous two-phase system composed of 27%C2H5OH and 16%Na2SO4 was used to extract total flavonoids from Agtiopllyllum squarrosum.The effects of crude extract mass fraction， NaCl mass fraction and pH value on the extraction efficiency of total flavonoids were explored by one-factor-at-a-time and Box-Benhnken design methods.Result:The optimal aqueous two-phase extraction conditions were crude extract mass fraction of 13.88%， NaCl mass fraction of 2% and pH of 8and extraction rate of 91.29%.Conclusion: Under this condition， the experiment is carried out， and the conclusion is basically in agreement with the theoretical value， which indicates that the model is reasonable and effective..

Response surface method； Aqueous two-phase system； Agtiopllyllum squarrosum； Flavonoids

R284.2