楊林，石紅霞，薛鴻燕，周小凱，劉曉風(fēng)

（1.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌、抗氧化活性研究

楊林1，石紅霞1，薛鴻燕1，周小凱1，劉曉風(fēng)1

（1.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

紫薯具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，且含有豐富的內(nèi)生菌，是抑菌及抗氧化等活性物質(zhì)的重要來源。本研究采用濾紙片法和紫外分光光度法對(duì)紫薯塊莖中分離得到的14株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物，進(jìn)行體外抑菌和抗氧化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸乙酯萃取部位抑菌活性最強(qiáng)，正丁醇部位活性強(qiáng)于菌體甲醇提取部位，其中，菌株ZS107的乙酸乙酯部位對(duì)革蘭氏陰性菌具有極顯著的抑菌活性；抗氧化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ZS101和ZS102的乙酸乙酯部位Vc當(dāng)量大于100mg/mL，ZS204的乙酸乙酯部位樣品的DPPH自由基清除能力明顯高于其他樣品，清除羥基自由基能力較弱。紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物，具有較好的抗菌及一定的抗氧化等活性，具有較高的研究?jī)r(jià)值。

紫薯 內(nèi)生真菌 抑菌 抗氧化

紫薯（Solanum tuberodsum L.），為旋花科甘薯屬草本植物，俗稱紫山芋、黑薯，薯肉為紫色至深紫色，又稱黑薯。具有通便、防癌、抗癌、清除自由基、抗衰老、抗突變、改善肝功能、降血壓、預(yù)防動(dòng)脈硬化等功能，是當(dāng)前首推的無公害、綠色、有機(jī)保健食品［1］。目前對(duì)紫薯的研究都集中在對(duì)紫薯色素的提取及性質(zhì)研究以及對(duì)紫薯花青素的研究，而對(duì)紫薯內(nèi)生菌的研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，紫薯中含有較為豐富的內(nèi)生真菌，是抗菌及抗氧化等活性物質(zhì)的重要來源，為進(jìn)一步從紫薯內(nèi)生菌中分離篩選新藥先導(dǎo)化合物提供了科學(xué)依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料

內(nèi)生真菌 于2014年，從新鮮無病害的紫薯塊莖中分離得到的14株內(nèi)生真菌，菌種保存于蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

試劑 DPPH（Aladdin chemistry Co.Ltd，96%，批號(hào)46046）、維生素C、水楊酸、無水乙醇、30% 過氧化氫，硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫、三氯乙酸、氯化鐵等試劑均為分析純。

儀器 AB104-N電子天平（Mettle-Toledo）；ES-2002H電子天平（長沙湘平）；CARY 50 Probe UV-Visible spectrophotometer （VARIAN Australia RTY LTD），RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮），SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），DZF-6020型真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

指示菌：G+性菌：金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、乳鏈球菌（Streptococcus uberi）和G－性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），菌種引自蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 代謝產(chǎn)物的發(fā)酵及處理

內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱內(nèi)活化3天，后接種于含200mL PDB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶?jī)?nèi)。置于轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中28℃下培養(yǎng)兩周。發(fā)酵結(jié)束后，將菌體與菌液離心分離。菌液依次用等體積的乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，分別合并有機(jī)相并回收溶劑，得乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位；菌體50℃烘箱干燥，研缽研磨均勻后，用30倍體積甲醇回流提取3次，每次1h，過濾，濾液回收甲醇，得菌體甲醇提取部位。各于50℃干燥至恒重，備用［2］。

1.2.2 抑菌活性測(cè)定

抑菌活性測(cè)定采用濾紙片法［3］。樣品用DMSO配制成5mg/mL樣液。調(diào)節(jié)菌體濃度至106CFU/mL，取100μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，并將直徑5mm的無菌濾紙片置于帶菌平板上，輕壓使其與培養(yǎng)基表面接觸，后用微量移液器吸取15μL樣液滴于紙片上，溶劑DMSO為陰性對(duì)照，10U的硫酸鏈霉素或25U的青霉素鈉為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行。于37℃培養(yǎng)24h，十字交叉法測(cè)定各樣品抑菌圈的大小。并對(duì)有較好抑菌效果的樣品使用二倍稀釋法［73］進(jìn)行最小抑菌濃度的測(cè)定，樣品用DMSO稀釋為5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL濃度。

1.2.3 抗氧化活性測(cè)定

總還原力的測(cè)定 采用鐵氰化鉀還原法。將樣品用DMSO配成1mg/mL溶液，取樣液2.5mL，依次加入0.2mol/L pH=6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL和l%鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液2.5mL。50℃水浴中保溫20min后快速冷卻。再加10%三氯乙酸溶液2.5mL（如有沉淀離心除去），取上清液2.5mL，依次加入蒸餾水2.5mL和0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，振蕩混勻，靜置10min后，在700nm處測(cè)定其吸光度值，同時(shí)以陽性對(duì)照Vc做標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出樣品Vc當(dāng)量［4］。

DPPH自由基清除活性的測(cè)定 采用水楊酸法，將樣品用DMSO配成0.05mg/mL溶液。在同一具塞試管中加入0.025mg/mL的DPPH·乙醇溶液和樣品溶液各2mL，搖勻，室溫避光靜置30min，用無水乙醇作參比溶液，在5l7nm處測(cè)量吸光度值A(chǔ)樣品。用2mL無水乙醇代替樣品，測(cè)定空白吸光度A空白。用2mL無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液，測(cè)定吸光度值為A對(duì)照［5］。如下公式計(jì)算：

羥基自由基清除活性的測(cè)定：將樣品用DMSO配成0.8mg/mL溶液。于10mL比色管中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵水溶液1mL，6mmol/L的水楊酸·乙醇溶液1mL后，加入1mL樣液，再加0.1%的過氧化氫1mL，用蒸餾水定容，搖勻后于37℃水浴30min， 510nm測(cè)吸光度值A(chǔ)樣。用1mLDMSO溶液代替樣品，測(cè)定空白吸光度A空白。用1mL水溶液代替H2O2，測(cè)定吸光度A對(duì)照 。按下式計(jì)算：

2、結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性測(cè)定結(jié)果

42個(gè)樣品中有17個(gè)樣品對(duì)6種指示菌均表現(xiàn)出抑制活性，占總測(cè)試樣品的40%；其中乙酸乙酯部位對(duì)6種指示菌均有抑制作用的有11個(gè)，正丁醇部位有4個(gè)，菌體甲醇部位有2個(gè)；有5個(gè)樣品對(duì)6種指示菌有較強(qiáng)的抑制作用（抑菌圈直徑10-20mm），分別是ZS102、ZS112、ZS204、ZS301的乙酸乙酯部位和ZS302的正丁醇部位；ZS107和ZS108的乙酸乙酯部位和ZS101、ZS102的正丁醇部位對(duì)6種指示菌均有很強(qiáng)的抑制作用（抑菌圈直徑20-45mm），其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)的為ZS107的乙酸乙酯部位，抑菌圈直徑為35mm，對(duì)地衣芽孢桿菌和乳鏈球菌抑制作用最強(qiáng)的為ZS108的乙酸乙酯部位，抑菌圈都為27mm，對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌抑制作用最強(qiáng)的均為ZS107的乙酸乙酯部位，抑菌圈直徑分別為41mm、42mm、41mm。抑菌試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示：(+++++) <35mm；(++++++)40mm；(+++++++)<45mm③低活性：中<15mm：中等活性1 5mm≤中<20mm：高活性：中≥20 mm

表1 紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定結(jié)果

對(duì)抑菌圈直徑大于20mm的樣品進(jìn)行最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果表明，ZS107的乙酸乙酯部位對(duì)肺炎克雷伯菌的抑制效果最強(qiáng)，其最小抑菌濃度為0.15625mg/mL，ZS108的乙酸乙酯部位對(duì)地衣芽孢桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度均達(dá)到0.15625mg/mL，ZS301的乙酸乙酯部位對(duì)地衣芽孢桿菌的最小抑菌濃度達(dá)到0.15625mg/mL；ZS101的正丁醇部位對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的最小抑菌濃度達(dá)到0.15625mg/mL，ZS102的正丁醇部位只有對(duì)肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度達(dá)到0.15625mg/mL，而ZS302的正丁醇部位除了對(duì)乳鏈球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度為2.5mg/mL為對(duì)其余4個(gè)指示菌的最小抑菌濃度都達(dá)到0.15625mg/mL， 最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果如表2:

表2 紫薯內(nèi)生真菌最小抑菌濃度MIC測(cè)定結(jié)果（mg/mL）

2.2 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 總還原力測(cè)定結(jié)果

42個(gè)樣品中表現(xiàn)出有還原總力的有41個(gè)，其中還原能力乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞菌體部位；Vc相當(dāng)含量超過100的有2個(gè)樣品，分別是ZS101和ZS102的乙酸乙酯部位；其中ZS102的乙酸乙酯部位最高，達(dá)到129.6μg/mL。如圖1

所示：

圖1 紫薯內(nèi)生真菌總還原力測(cè)定結(jié)果

2.2.2 清除DPPH.測(cè)定結(jié)果

42個(gè)樣品表現(xiàn)出DPPH自由基清除活性的有26個(gè)，占總樣品的61.9%；其中只有ZS204的乙酸乙酯部位的清除率大于50%（84.57%）；其他樣品對(duì)DPPH自由基的清除作用均較弱。Vc的清除率為96%。測(cè)定結(jié)果如圖2所示：

圖2 紫薯內(nèi)生真菌對(duì)DPPH·自由基清除作用測(cè)定結(jié)果

2.2.3 清除羥基自由基測(cè)定結(jié)果

40個(gè)樣品有一定的清除作用，清除率均小于50%，整體清除效果較差。對(duì)羥基自由基的清除作用最強(qiáng)的是ZS107的乙酸乙酯部位（40.23%）。整體來看，乙酸乙酯部位樣品清除率高于正丁醇和菌體部位。如圖3所示：

圖3 紫薯內(nèi)生真菌對(duì)羥基自由基的清除作用

3、結(jié)果及討論

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)指示菌具有一定的抑菌活性，乙酸乙酯部位抑菌活性強(qiáng)于正丁醇部位，正丁醇部位強(qiáng)于菌體甲醇部位。其中，ZS107的乙酸乙酯部位對(duì)3種革蘭氏陰性菌的抑菌效果極明顯，抑菌圈均大于40mm，超過Vc的抑菌圈，有必要對(duì)該菌進(jìn)行進(jìn)一步研究，有望從中發(fā)現(xiàn)抑菌活性較好的化合物。

抗氧化結(jié)果表明，總還原能力測(cè)試中Vc相當(dāng)含量高的樣品較少，DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中ZS204的乙酸乙酯部位的清除率較高。對(duì)羥基自由基的清除作用不太明顯，說明紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性較弱。

本研究為后續(xù)紫薯研究和利用作了一定的鋪墊，也為從紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中分離得到抗氧化，抑菌作用的化合物提供依據(jù)。

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