王文健 趙瑞君 李 珀 杜 斌 原發(fā)家 聶守民 程璟俠 李彥紅

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，寄生蟲學(xué)教研室，太原 030001； 2. 山西省疾病預(yù)防控制中心病媒生物防控科，太原 030001; 3.山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科, 太原 030001)

如今臨床抗感染治療中抗生素在面對(duì)諸多耐藥菌株時(shí)已失去昔日的輝煌，青霉素的時(shí)代即將逝去，一個(gè)嶄新的時(shí)代就要來臨——抗菌肽時(shí)代。自Boman等(1980)從天蠶蛹的血淋巴中分離得到天蠶素(Cecropin)抗菌肽A和B,使人們對(duì)抗菌肽的作用機(jī)理和應(yīng)用有了一個(gè)嶄新的認(rèn)識(shí)(Hou，2007)。Sup-b15細(xì)胞株屬于人Ph+急淋白血病(ALL)細(xì)胞系。在我國ALL發(fā)病率約為0.67/10萬。ALL兒童期(0～9歲)為發(fā)病高峰，可占兒童白血病的70%以上，ALL在成人中占成人白血病的20%左右。在治療方面，傳統(tǒng)的放化療副作用太大，這就需要尋找一種更為有效且副作用低的治療方式。對(duì)于家蠅Muscadomestica抗菌肽的研究，趙瑞君等(2007)和丘曉燕等(2003)發(fā)現(xiàn)其粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞109、K562、Daudi、T24、MCF-7、BGC-823、MCC-803、SPA-A-1均有抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞沒有抑制。通過查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料未發(fā)現(xiàn)有關(guān)家蠅幼蟲抗菌肽對(duì)sup-b15細(xì)胞及粗提物與純化物的對(duì)比研究。本實(shí)驗(yàn)旨在為將來有關(guān)這方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料：家蠅Muscadomestica三齡幼蟲由山西省疾病預(yù)防控制中心提供；大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存，sup-b15細(xì)胞株由山西醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院血液科惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑和設(shè)備：苯甲基磺酰氟(PMSF)，美國Sigma公司；IMDM培養(yǎng)基，博士德生物；胎牛血清，杭州四季青公司；CCK-8試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，上海前塵生物科技有限公司；反相高效液相色譜儀TG328B，美國Agilent公司；真空冷凍干燥機(jī) FD-1-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；核酸蛋白測(cè)定儀，德國艾本德公司；流式細(xì)胞儀 FACS Calibur，B.D Corp，USA。

1.2 方法

1.2.1抗菌肽提取分離純化：將家蠅三齡幼蟲以同等質(zhì)量隨機(jī)分成兩組，其中一組(誘導(dǎo)組)用昆蟲針蘸取大腸桿菌菌液針刺幼蟲后腹壁脂肪層，另一組(對(duì)照組)不做處理，繼續(xù)飼養(yǎng)24 h。將兩組幼蟲分別置于預(yù)冷的研缽中冰浴研磨，同時(shí)加入m(g)/V(mL)=1/3提取液(內(nèi)含1 mmol/L PMSF的生理鹽水)。研磨后以12 000 r/min，4℃離心30 min，取上清，重復(fù)離心3次，4℃保存。經(jīng)Sep-Pak C18柱固相萃取(樊宏英，2011)得到家蠅幼蟲抗菌肽粗提物，保存于-80℃冰箱。利用反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)進(jìn)行分離純化，并記錄出峰情況，根據(jù)出峰時(shí)間收集蛋白質(zhì)并分裝標(biāo)記。再將其與粗提物放入-80℃冰箱預(yù)凍24h后置于真空冷凍干燥機(jī)濃縮，36 h后用PBS重溶檢測(cè)濃度，-20℃冷凍保存。

1.2.2CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增值抑制率：培養(yǎng)sup-b15(懸浮細(xì)胞)選用含20%胎牛血清1%雙抗的IMDM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，每2～3 d換液，5～6 d傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整濃度至2×104cells/mL，加入96孔板，每孔100 μL，每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將各組抗菌肽50 μL(100 μg/mL)加入對(duì)應(yīng)孔中，對(duì)照組加入50 μL PBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)。36 h后(對(duì)照組處于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)向每孔加入15 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，450 nm檢測(cè)吸光度(OD值)，并記錄各組數(shù)值。根據(jù)公式計(jì)算出各組抗菌肽的細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%

1.2.3用Annexin V-FITC-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)sup-b15的凋亡率：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期sup-b15細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106cells/mL，加入24孔板(每孔1 mL),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將0.5 mL終濃度為100 μg/mL的各組抗菌肽加入實(shí)驗(yàn)組各孔，對(duì)照組每孔加入0.5 mL PBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)36 h。待培養(yǎng)完后2 000 r/min、4℃離心5 min，棄上清液收集懸浮細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞(2 000 r/min、4℃離心5 min)兩次，再加入400 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，收集濃度大約5×105cells/mL。在細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4℃避光條件下孵育15 min。最后加入10 μL PI染色液輕輕混勻于4℃避光條件下孵育5 min，30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽分離純化蛋白R(shí)P-HPLC色譜圖分析

通過對(duì)比兩張峰值圖發(fā)現(xiàn)，圖1-B中保留時(shí)間為3.741、7.499、32.746、33.318的峰值較圖1-A明顯增高，說明這些蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)刺激后表達(dá)量顯著增加；圖1-B較圖1-A新出現(xiàn)了保留時(shí)間為4.973、12.209、14.982、15.240的峰，說明經(jīng)誘導(dǎo)刺激后有新生成的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。這些蛋白即為實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究的家蠅幼蟲純化抗菌肽。為此我們將含量增加(Increased)保留時(shí)間為3.741、7.499、32.746、33.318的蛋白按順序分別標(biāo)記為I1、I2、I3、I4組；新生成(Generate)保留時(shí)間為4.973、12.209、14.982、15.240的蛋白按順序分別標(biāo)記為G1、G2、G3、G4組；誘導(dǎo)組抗菌肽粗提物(Extracts)標(biāo)記為E0組。

2.2 CCK-8試劑盒檢測(cè)家蠅幼蟲抗菌肽對(duì)sup-b15細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

CCK8結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，I1、I2、I4、G2、E0組細(xì)胞生長(zhǎng)得到明顯抑制，五組細(xì)胞的生存率(圖2)分別為0.714±0.032、0.785±0.023、0.641±0.065、0.686±0.034、0.561±0.025,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余組與對(duì)照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 RP-HPLC色譜圖(A：對(duì)照組B：誘導(dǎo)組)Fig.1 RP-HPLC chromatogram (A: Control group B: Induction group)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)家蠅幼蟲抗菌肽對(duì)sup-b15細(xì)胞引起的細(xì)胞凋亡作用結(jié)果

我們根據(jù)CCK-8檢測(cè)結(jié)果，選取對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制明顯的I1、I2、I4、G2、E0五組進(jìn)行流式實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(圖3，表1)經(jīng)卡方檢驗(yàn)組間比較可得，I1、I2、I4、G2、E0組對(duì)sup-b15細(xì)胞均具有一定的促凋亡作用，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，E0組細(xì)胞凋亡明顯，而I1、I2、I4、G2組促凋亡作用均弱于E0組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表 1 各組抗菌肽作用sup-b15細(xì)胞凋亡結(jié)果Tab.1 Apoptotic role of antimicrobial peptides sup-b15

圖2 各組抗菌肽作用sup-b15細(xì)胞的生存率Fig.2 Cell survival of antimicrobial peptides in each group sup-b15其中橫坐標(biāo)1～9分別代表I1、I2、I3、I4、G1、G2、G3、G4、E0組。1-9 in the abscissa represent I1, I2, I3, I4, G1, G2, G3, G4, E0 group.

圖3 各組抗菌肽對(duì)sup-b15細(xì)胞的凋亡作用Fig.3 Apoptosis in each group of antimicrobial peptides sup-b15 cells其中圖ABCDEF分別代表對(duì)照組、I1、I2、I4、G2、E0組ABCDEF represent the control group, I1, I2, I4, G2, E0 group， respectively.

3 討論

近年來國內(nèi)外有許多學(xué)者一直致力于抗菌肽的研究中，已從多種生物體內(nèi)(如昆蟲、植物、動(dòng)物及人體內(nèi))提取出抗菌肽。在ANTIMIC(目前最大的抗菌肽數(shù)據(jù)庫)已收錄抗菌肽種類達(dá)1 700余種(均為非人工合成、自然存在的抗菌肽)。在SAPD數(shù)據(jù)庫現(xiàn)已收錄246種不同的人工抗菌肽(Suttmannetal.，2008)，目前已分離、有些已測(cè)定了氨基酸序列的昆蟲抗菌肽達(dá)到100余種,其中蠅類就達(dá)17種(李改瑞等，2010)。家蠅有著能夠在雜菌橫生的環(huán)境里生長(zhǎng)但自身卻很少因患病而死亡的特點(diǎn)，以及在我國分布廣、數(shù)量多、容易養(yǎng)殖、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，這就使得家蠅抗菌肽對(duì)我們更有科研意義和醫(yī)用價(jià)值。然而隨著家蠅抗菌肽對(duì)于腫瘤的研究不斷深入預(yù)示其作為抗腫瘤藥物，有著廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了家蠅幼蟲抗菌肽對(duì)sup-b15細(xì)胞有增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。而且在利用RP-HPLC對(duì)抗菌肽粗提物分離純化實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)上加設(shè)了對(duì)照組，較樊宏英等(2011)、魏洪等(2011)的方法更具有科學(xué)性，實(shí)驗(yàn)通過誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組的對(duì)比證明了目的蛋白是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生或誘導(dǎo)之后含量是明顯增加的，而并非家蠅幼蟲本身就存在或誘導(dǎo)無差異。實(shí)驗(yàn)利用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離純化目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示目的蛋白確實(shí)對(duì)sup-b15細(xì)胞有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，這與金小寶等(2012)、程璟俠等(2014)用純化抗菌肽作用諸多腫瘤細(xì)胞的結(jié)果相符。

研究過程中發(fā)現(xiàn)，并非所有目的蛋白對(duì)sup-b15細(xì)胞的抑制作用均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，有些甚至促進(jìn)其生長(zhǎng)(生存率>1，如G3組蛋白)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果說明粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用效果較純化蛋白明顯。本實(shí)驗(yàn)以質(zhì)量濃度為單位，在相同條件下粗提物各有效成分含量均低于純化蛋白，作用效果應(yīng)低于純化蛋白，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示卻與之相反。這與提純的中藥成分往往不如“本草”的療效具有相似性，還需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深一步的研究。發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的抗腫瘤機(jī)制比較復(fù)雜，迄今為止仍沒有一種公認(rèn)的學(xué)說能夠闡明抗菌肽抗腫瘤的作用機(jī)制(王芳和張雙全，1999；張雙全等，2002；金小寶等，2011；夏麗潔等，2014)，歸納總結(jié)其機(jī)制主要是通過接觸性抑制和非接觸性抑制兩個(gè)方面殺傷腫瘤細(xì)胞(Orsolicetal.，2005)?？咕拇痔嵛锍煞种杏幸恍┑鞍啄軌蛑苯託[瘤細(xì)胞，而另一些對(duì)其不產(chǎn)生抑制作用的蛋白在整個(gè)反應(yīng)過程中又扮演什么樣的角色？雖然抗菌肽相關(guān)文獻(xiàn)還沒有這方面的相關(guān)報(bào)道，但是在查看抗菌肽抑菌作用的論文時(shí)得到不少啟示：幾種蛋白之間類似于抗菌肽和抗生素聯(lián)合作用抑菌時(shí)存在協(xié)同作用(劉倚帆等，2010；宮霞等，2005)；某些蛋白對(duì)其他有直接抑殺作用的蛋白起到表達(dá)調(diào)控的作用(張龔煒等，2009)；作為佐劑(陳立春，2012)在免疫表達(dá)方面起到至關(guān)重要的作用；作為酶起到催化作用，促進(jìn)有抑制作用的蛋白產(chǎn)生功效；其中兩種，甚至幾種無效的蛋白之間存在聚合反應(yīng)從而抑制腫瘤；是凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)激活了原先無效的蛋白。以上是一些具有可能性的預(yù)想，還需要進(jìn)一步的研究來論證。雖然目前對(duì)蠅源抗菌肽各方面的研究還不夠透徹，更缺乏臨床實(shí)驗(yàn)作為理論依據(jù)，相信在不久的將來抗菌肽將以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)為人類服務(wù)的。