杜 斌 趙瑞君** 程璟俠 王文健 原發(fā)家 聶守民 李彥紅

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，寄生蟲學(xué)教研室，太原 030001; 2. 山西省疾病預(yù)防控制中心病媒生物防控科，太原 030001； 3. 山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科, 太原 030001)

昆蟲抗菌肽是相對(duì)較早涉及腫瘤研究的生物制劑(梅寒芳等，2009)?？咕膶?duì)腫瘤的抑制及殺傷作用(Suttmannetal.,2008)已有一定研究。本課題組利用家蠅幼蟲的抗菌肽粗提物來(lái)尋找其最適宜的作用濃度，作為后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的過(guò)渡實(shí)驗(yàn)。為了模擬到體內(nèi)環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建C57BL/6小鼠患紅白血病的模型(吳遠(yuǎn)彬等，2010)并獲得FBL-3原代細(xì)胞。原代培養(yǎng)最大的優(yōu)點(diǎn)是組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。

目前國(guó)內(nèi)外研究抗菌肽抗腫瘤機(jī)制的實(shí)驗(yàn)較多。Biragyn等(2001)用編碼非免疫原性淋巴瘤抗原與鼠B-defensin融合蛋白的DNA 質(zhì)粒免疫大鼠,可在大鼠體內(nèi)引起明顯的IgG 免疫應(yīng)答和抗腫瘤活性; Xu 等(2007)采用鼠源性B-defensin 2及IL-18 基因共轉(zhuǎn)染L1210 細(xì)胞, 免疫大鼠后, 可產(chǎn)生比單獨(dú)轉(zhuǎn)染B-defensin 2 或IL-18 基因更強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究抗菌肽對(duì)紅白血病是否有抑制作用未曾見到報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)的研究旨在尋找療效好副作用少的新型生物治療方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1家蠅MuscadomesticaⅢ齡幼蟲：多代培養(yǎng)的純種品系，山西省疾病預(yù)防控制中心蟲媒科的養(yǎng)蠅室飼養(yǎng)。

1.1.2腫瘤細(xì)胞：FBL-3紅白血病細(xì)胞，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物所引進(jìn)；原代FBL-3細(xì)胞，通過(guò)實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物模型取組織并培養(yǎng)獲得。

1.1.3C57BL/6小鼠：斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。

1.1.4主要試劑及設(shè)備：苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)(美國(guó) Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，青鏈霉素混合液(10 000 U/mL青霉素和1 000 μg/mL鏈霉素)，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒(碧云天 Beyotime)， CCK-8試劑盒(碧云天 Beyotime)， Eppendorf Biophotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)艾本德公司)，奧林巴斯IX83倒置顯微鏡(奧林巴斯中國(guó)有限公司)，Count star自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，Eon微孔板分光光度計(jì)(美國(guó)Biotek公司)。

1.2 方法

1.2.1大腸桿菌誘導(dǎo)和勻漿：取家蠅Ⅲ齡幼蟲3 g，用昆蟲針蘸E.coliDH5a針刺其體壁腹后誘導(dǎo)，每蟲1針，處理后置于燒杯內(nèi)于室內(nèi)飼養(yǎng)24 h。然后置于預(yù)冷的研缽中，按1 g幼蟲加入0.5 mL 內(nèi)含1 mmol/L PMSF的生理鹽水，冰浴研磨，于4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清，重復(fù)離心2次。

1.2.2Sep-Pak C18柱固相萃取：以5 mL甲醇洗柱，然后以5 mL三蒸水平衡柱體。將上清液4 ℃、12 000 r/min離心30 min。盡量減少雜質(zhì)，取上清上柱，每柱上樣5 mL，以三蒸水洗柱，記為流通液，以5 mL 80 %濃度的乙腈水溶液(三蒸水配制)洗脫柱體，手動(dòng)收集洗脫組分并保存于-70 ℃冰箱24 h，真空凍干機(jī)干燥， 最后用PBS重溶，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其濃度。

1.2.3動(dòng)物模型構(gòu)建：選取6～8周齡C57BL/6雄性小鼠(體重約為20 g)，把處于傳代期(對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期)FBL-3紅白血病細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射，注射濃度為2.5×106/mL，劑量為200 μL。約一周后，可以在小鼠腋下摸到質(zhì)硬邊緣整齊的腫塊。將3組(每組6只)不同批次C57BL/6雄性小鼠，經(jīng)相同方法處理，均有腫塊出現(xiàn)。

1.2.4FBL-3原代細(xì)胞獲取及培養(yǎng)：處死小鼠，消毒，于超凈工作臺(tái)剝離腋下腫瘤，保持腫瘤的完整性。剪碎并置于200目濾網(wǎng)上，邊研磨邊用10 mL無(wú)鈣鎂PBS沖洗，收集研磨液，轉(zhuǎn)入離心管，1 000 r/min 離心5 min。棄上清，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液，約2 min，除去沉淀中的紅細(xì)胞，加入5 mL無(wú)鈣鎂PBS，離心5 min，1 000 r/min。棄上清，加入完全培養(yǎng)基(培養(yǎng)基∶胎牛血清=9∶1，抗生素1 000 U/10 mL)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，然后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.5倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：將處于對(duì)數(shù)期的FBL-3原代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后轉(zhuǎn)移入4個(gè)培養(yǎng)皿，約5 000個(gè)/皿。加入900 μL完全培養(yǎng)基，各培養(yǎng)皿加入濃度為250、330、420 μg/mL的抗菌肽混合物100 μL，PBS組加入100 μL PBS，培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率：用胰酶將培養(yǎng)皿的細(xì)胞分別消化置于2 mL離心管，離心，棄上清。再各加 1 mL細(xì)胞重懸液。用移液槍吸取100 μL重懸的細(xì)胞加入100 μL臺(tái)盼藍(lán)染色液，輕輕混勻，染色3 min。吸取20 μL經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞在自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)下觀察并計(jì)算生存率。

1.2.7CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性：胰酶消化處于對(duì)數(shù)期的FBL-3原代細(xì)胞，于96孔板培養(yǎng)，每孔細(xì)胞數(shù)約為5 000個(gè)，加入180 μL完全培養(yǎng)基，再各加20 μL抗菌肽混合物(除對(duì)照組)。設(shè)置Blank組與實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組按濃度 150、200、250、300、350、400 μg/mL分為6個(gè)梯度，Blank組加20 μL PBS。放到37 ℃、5 %的CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，之后吸掉原有培養(yǎng)基，每孔再加入200 μL 試劑(180 μL完全培養(yǎng)基和20 μL CCK-8試劑)繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀(Eon)在波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察不同濃度抗菌肽混合物作用FBL-3原代細(xì)胞的結(jié)果

將抗菌肽混合物調(diào)整濃度(250、330、420 μg/mL)作用處于對(duì)數(shù)期的FBL-3原代細(xì)胞，PBS作為對(duì)照，結(jié)果如圖1所示。圖1(a)，作用濃度為250 μg/mL，細(xì)胞受損嚴(yán)重，視野中可以看到大量細(xì)胞碎片，細(xì)胞胞膜不完整，內(nèi)容物外泄。圖1(b)，在330 μg/mL作用下視野中可觀察到跟多細(xì)胞碎片，而且細(xì)胞貼壁情況較差。圖1(c，d)，作用濃度為420 μg/mL，一部分細(xì)胞碎裂，也有較多細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，有貼壁現(xiàn)象。圖1(e)，PBS組細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)正常，能夠很好的貼壁。

2.2 臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞的存活率

利用count stars細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色可以獲知PBS組、150、250、350、450 μg/mL組的FBL-3原代細(xì)胞細(xì)胞存活率，經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，如表1。

抗菌肽濃度(μg/mL)Concentrations ofantimicrobial peptide細(xì)胞生存率(%, x±s)Survival rate對(duì)照組PBS group74.906±0.38815064.713±0.43025031.653±0.54335049.426±0.52145072.790±0.622

2.3 CCK-8檢測(cè)不同濃度抗菌肽混合物作用下FBL-3原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性

如表2六個(gè)濃度組的抗菌肽混合物均可對(duì)FBL-3原代細(xì)胞帶來(lái)影響，各實(shí)驗(yàn)組與正常組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。250、300、350 μg/mL，兩兩比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞毒性隨抗菌肽混合物濃度的增加先增大后減小，在300 μg/mL作用下，其毒性最大，如圖2。

表2 不同濃度抗菌肽混合物對(duì)FBL-3原代細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響Tab.2 The change of cytotoxicity of FBL-3 primary cell by different concentrations

* 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05.

* Significant difference,P<0.05.

圖2 各濃度抗菌肽混合物作用下的細(xì)胞毒性Fig.2 Cytotoxicity by Antimicrobial peptides with different concentrations

3 討論

昆蟲抗菌基因的表達(dá)產(chǎn)物有抗菌肽、溶菌素、凝集素、血素等抗菌蛋白和多糖類物質(zhì)，而其中抗菌肽是最主要的物質(zhì)。GenBank已注冊(cè)的家蠅抗菌肽基因有天蠶素cecropin、防御素defensin、攻擊素attacin和雙翅抗菌肽diptericin 4種。金小寶等(2012)發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽cecropin能夠抑制人肺癌細(xì)胞株A549、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞株Hela和人肝癌細(xì)胞 BEL-7402等人源性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)發(fā)生凋亡。焦莉萍等(2014)利基因工程技術(shù)合成防御素defensin同樣也對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2有抑制作用，作用濃度需達(dá)到680 μg/mL。通過(guò)分子克隆、表達(dá)、純化可以得到純化單一的抗菌肽，但基因工程技術(shù)生產(chǎn)的抗菌肽還有許多尚未解決的問(wèn)題: 原核表達(dá)系統(tǒng)雖然操作簡(jiǎn)便，但抗菌肽基因作為真核基因在原核系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白往往不能有效正確的翻譯，從而因空間結(jié)構(gòu)上的差異影響表達(dá)抗菌肽的活性; 抗菌肽對(duì)表達(dá)載體都有抗殺作用，表達(dá)產(chǎn)物易降解?；诖耍緦?shí)驗(yàn)選擇使用提取量大而且作用效果更加明顯的抗菌肽粗提物。修江帆等(2014)研究表明微生物誘導(dǎo)比物理刺激誘導(dǎo)后家蠅免疫相關(guān)基因表達(dá)水平高，故本實(shí)驗(yàn)參考趙瑞君等(2008)的方法選擇大腸桿菌針刺誘導(dǎo)。Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取得到每3 gⅢ齡幼蟲可獲得1.5g～2.0 g(濃度為0.6～0.8 mg/mL)的抗菌肽粗提物。表明，傳統(tǒng)方法在產(chǎn)量方面有一定的優(yōu)勢(shì)。

抗菌肽具有抗腫瘤作用已經(jīng)被諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但對(duì)于其作用于紅白血病的研究鮮有，本實(shí)驗(yàn)以紅白血病原代細(xì)胞作為研究對(duì)象，其生物特性更接近于生物體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更具有指導(dǎo)意義。

已經(jīng)證實(shí)，Cecropin、Defensin均有抗腫瘤活性，如果二者混合，以混合抗菌肽的形式作用腫瘤細(xì)胞將會(huì)有怎樣的效果，故本實(shí)驗(yàn)選擇家蠅Ⅲ齡幼蟲抗菌肽粗體物來(lái)實(shí)現(xiàn)二者甚至于4抗菌肽的混合作用于腫瘤細(xì)胞。Cecropin A對(duì)早幼粒性白血病細(xì)胞HL-60 具有抗腫瘤作用(Ceronetal.,2010)。根據(jù)MTT 和LDH 實(shí)驗(yàn)，CA 作用后細(xì)胞活力以劑量依賴方式遞減。臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)以此為參考，但結(jié)果如圖表1顯示在混合物濃度為350 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率卻有提高。繼而開展CCK-8檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，再次證實(shí)當(dāng)濃度低于300 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞的作用有濃度依賴性。作用于細(xì)胞的混合物濃度繼續(xù)增大，細(xì)胞毒性反而減小，如表2和圖2所示。以抗菌肽混合物作為實(shí)驗(yàn)藥物作用FBL-3原代細(xì)胞，從顯微鏡觀察圖像和CCK-8檢測(cè)數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探究得到了FBL-3原代細(xì)胞增殖的影響濃度為300 μg/mL，對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)具有指導(dǎo)意義。而為什么抗菌肽混合物對(duì)FBL-3增殖影響不完全有濃度依賴性，可能與腫瘤細(xì)胞的種類相關(guān)，也可能與抗菌肽混合物本身的有效成分相關(guān)，對(duì)此將會(huì)做進(jìn)一步研究。