崔 杰 周金林

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

蜱屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、蛛形綱(Arachnida)、蜱螨目(Acarina)、蜱總科(Ixodoidea)，是常見的動物體表寄生蟲之一，具有復(fù)雜的生活史和高繁殖率，是一種重要的疾病傳播媒介，侵襲包括人在內(nèi)多種宿主，廣泛分布于世界各地(周金林, 2004)?，F(xiàn)代蜱研究已從蜱生物學(xué)性狀觀察發(fā)展到分子生物學(xué)領(lǐng)域，其中，RNA干擾技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。RNA干擾技術(shù)首先從秀麗線蟲研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ire等(1998)用純化的雙鏈RNA特異性降解目的基因轉(zhuǎn)錄序列，在對目的基因沉默表達(dá)分析過程中提出RNA干擾概念。自此，RNA干擾技術(shù)成為最有效基因功能研究工具之一，迅速拓展到蟲媒研究領(lǐng)域。Aljamali等(2002)最早將RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于蜱研究，通過體外浸泡和體內(nèi)注射雙鏈RNA的方法，干擾美洲花蜱Amblyommaamericanum的組胺結(jié)合蛋白基因。蜱研究中實(shí)現(xiàn)RNA干擾的關(guān)鍵在于雙鏈RNA的導(dǎo)入，已有多種RNA干擾方法得到成功應(yīng)用，如顯微注射法、浸泡法、飼喂法、病毒轉(zhuǎn)染法和電轉(zhuǎn)染法等。通過生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合蜱生理學(xué)指標(biāo)變化對目的基因沉默效果進(jìn)行評價(jià)與分析，人們發(fā)現(xiàn)了蜱體多種新型生物活性分子，這些物質(zhì)在蜱抗凝血和免疫抑制等生理過程中發(fā)揮重要作用，在新醫(yī)藥生物制劑開發(fā)研制，蜱及蜱傳疾病的防治等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。本文就蜱RNA干擾方法及其適用性作一綜述，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 蜱體RNA干擾機(jī)制

RNA干擾是在基因序列轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生特異性沉默表達(dá)的現(xiàn)象。在蜱體內(nèi)，一段雙鏈RNA進(jìn)入蜱細(xì)胞后，經(jīng)過一系列生化反應(yīng)降解同源mRNA，調(diào)節(jié)相關(guān)編碼基因不能表達(dá)(Kurscheidetal., 2009)。

RNA干擾的主要過程分為3個(gè)階段：首先，雙鏈RNA通過細(xì)胞表面進(jìn)入蜱體細(xì)胞內(nèi)，與雙鏈RNA核酸內(nèi)切酶(Dicer)特異性結(jié)合，被其中的RNase III成份切割成21～25 nt大小的小干擾RNA(siRNA)(Elbashiretal., 2001)。隨后，形成的siRNA與一些酶蛋白家族成員結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，激活后的RISC核酸部分即siRNA，與目的mRNA同源，引導(dǎo)識別靶mRNA，蛋白部分從酶切位點(diǎn)開始對靶mRNA降解(Hannon, 2002)。同時(shí)，斷裂的RNA小分子在核酸酶作用后經(jīng)過核酸內(nèi)切酶等作用又形成新的雙鏈RNA，這些雙鏈RNA又會被Dicer切割成siRNA，形成降解目的mRNA的循環(huán)(Yuetal., 2002)。

根據(jù)這一機(jī)制的理解，通過構(gòu)建啟動子的方法體外合成雙鏈RNA，以實(shí)現(xiàn)RNA干擾實(shí)驗(yàn)(de la Fuenteetal., 2007)。值得注意的是，合成的雙鏈RNA應(yīng)具備一定的長度，研究表明，長鏈產(chǎn)生的干擾效果明顯強(qiáng)于短鏈，有效干擾的長度范圍應(yīng)大于50～200 bp，現(xiàn)有文獻(xiàn)中常用的雙鏈RNA長度在134 ～1 842 bp之間(Scottetal., 2013)。

2 蜱研究中RNA干擾方法

在目前蜱研究中，RNA干擾方法主要分為5類，包括顯微注射法、浸泡法、飼喂法、病毒轉(zhuǎn)染法和電轉(zhuǎn)染法等。這些方法均能夠?qū)Ⅲw外雙鏈RNA有效導(dǎo)入蜱體細(xì)胞中，但是根據(jù)不同的蜱種類與蜱體發(fā)育階段這些方法效果不同，本文重點(diǎn)總結(jié)不同實(shí)驗(yàn)方法研究進(jìn)展及其應(yīng)用適用性，對各方法特點(diǎn)進(jìn)行討論。

2.1 顯微注射法

指將蜱體外合成的雙鏈RNA通過顯微注射技術(shù)注入蜱體內(nèi)的方法。使用的工具有漢密爾頓注射器、微量注射器及顯微注射儀(de la Fuenteetal., 2006a; de la Fuenteetal., 2006b; de la Fuenteetal., 2007)。注射實(shí)驗(yàn)過程需要具備一定實(shí)驗(yàn)技能的人員在顯微鏡下操作。注射的部位可以是蜱特定器官組織，包括唾液腺、淋巴結(jié)、卵巢、腸道等，也可以直接從蜱腹側(cè)右下第4基節(jié)處或蜱體氣孔處注入(Nijhofetal., 2007)。注射劑量根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c實(shí)驗(yàn)對象的不同而改變。這種方法具有高通量特點(diǎn)，操作重復(fù)性好，可控制注入雙鏈RNA劑量，成本較低，是實(shí)驗(yàn)前期探尋功能基因與相關(guān)分子的首選方法，廣泛應(yīng)用于蜱分子生物學(xué)研究。然而，實(shí)驗(yàn)人員的顯微注射操作時(shí)間相對于其他方法較長，其中蜱的固定操作繁瑣，須保證蜱的固定與活力，多方面的條件限制決定該方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室分析階段，難以滿足應(yīng)用于大量蜱的生產(chǎn)實(shí)踐過程，使用的工具較為精密，需要專業(yè)人員操作。

目前，蜱相關(guān)功能基因分子研究中已對蜱成蜱階段的顯微注射進(jìn)行了大量報(bào)道。該方法是探知目的基因功能的研究方法，Galay等(2013，2014)運(yùn)用顯微注射法對目的基因HIFER進(jìn)行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)目的基因蜱體儲存鐵質(zhì)與保護(hù)蜱體鐵蛋白功能。同時(shí)，此方法應(yīng)用于對已知功能分子的功能驗(yàn)證與評測，Yu等(2013)發(fā)現(xiàn)鐮形扇頭蜱Rhipicephalushaemaphysaloides兩種新的絲氨酸蛋白酶，運(yùn)用顯微注射法進(jìn)行RNA干擾，測試抗凝血功能。值得注意的是，顯微注射法在蜱疫苗靶抗原研究方面具有重要應(yīng)用價(jià)值，Mulenga等(2013)通過該方法進(jìn)行RNA干擾發(fā)現(xiàn)一組新的節(jié)肢動物蛋白AamAV422，作為普遍適用于多種類蜱多價(jià)疫苗候選分子。Bifano等(2014)對蜱胚胎細(xì)胞系BME26進(jìn)行研究，在構(gòu)建消減雜交文庫后，針對蜱目的基因進(jìn)行顯微注射方法，實(shí)現(xiàn)RNA干擾，探究目的基因功能，分析得到功能基因組。

2.2 浸泡法

這種方法是在體外合成雙鏈RNA，經(jīng)過與一定的試劑相混合，直接浸泡蜱實(shí)驗(yàn)材料以實(shí)現(xiàn)RNA干擾。這些材料包括：蜱發(fā)育成熟前幾個(gè)階段的蟲體(如蜱卵階段、幼蜱階段、若蜱階段等)，從蜱體分離處理得到的組織(如唾液腺)(Bowmanetal, 2004)以及體外培養(yǎng)而得的細(xì)胞系等(Barryetal., 2013)。與雙鏈RNA相混合的試劑主要成分為轉(zhuǎn)染試劑，其作用是包裹具有一定長度的雙鏈RNA能夠透過蜱角質(zhì)板，從而使雙鏈RNA滲透進(jìn)入蜱體內(nèi)發(fā)揮作用。

浸泡法操作簡易，易于改變與控制浸泡變量，探索最佳實(shí)驗(yàn)條件，如蜱種類、浸泡時(shí)間、浸泡濃度等，以達(dá)到最佳干擾效果。能夠應(yīng)用于對大量蟲體的浸泡過程，覆蓋廣泛，因其具有操作快捷便利特點(diǎn)而具有實(shí)踐意義。但是，浸泡法消耗的雙鏈RNA較多，材料成本高，浸泡之前試劑準(zhǔn)備工作較為復(fù)雜。例如，將雙鏈RNA導(dǎo)入蟲體細(xì)胞時(shí)，需要測試選擇不同的轉(zhuǎn)染試劑，Whyard等(2009)將不同種類的的轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)用于不同種類昆蟲的RNA干擾浸泡實(shí)驗(yàn)，得出不同轉(zhuǎn)染劑產(chǎn)生不同浸泡干擾效果的結(jié)論。這些已商品化應(yīng)用于節(jié)肢動物的轉(zhuǎn)染劑有Lipofectamine 2000、Cellfectin、DMRIE-C、Transfectin等，然而，這些轉(zhuǎn)染試劑是否適用于蜱尚需進(jìn)一步研究。

這種方法最早的報(bào)道是應(yīng)用于蜱唾液腺體外浸泡實(shí)驗(yàn)，Aljamali等(2002，2003)等通過這種方法研究蜱體相關(guān)抗凝血蛋白分泌及相關(guān)功能基因。隨后，浸泡法應(yīng)用于蜱細(xì)胞系，de la Fuente等(2005，2006a)使用浸泡法浸泡蜱IDE8細(xì)胞，降低mRNA表達(dá)水平。如今，研究者們運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，通過對蜱體直接噴灑雙鏈RNA，實(shí)現(xiàn)對蟲體浸泡進(jìn)行RNA干擾，以達(dá)到干擾蜱正常生活習(xí)性目的，即新型殺蜱劑。相對于傳統(tǒng)殺蜱劑而言，這種以RNA干擾技術(shù)為原理的新型殺蜱劑更加具有生態(tài)環(huán)保意義，更加適宜于生態(tài)保護(hù)，避免蟲體耐藥問題。一方面，雙鏈RNA做為有效成分可以直接對蜱體靶基因?qū)崿F(xiàn)沉默，影響蜱正常生理指標(biāo)，如抑制蜱對宿主的吸血能力，破壞對原有生活環(huán)境的適應(yīng)能力等；另一方面，針對耐藥基因進(jìn)行干擾，結(jié)合傳統(tǒng)化學(xué)殺蜱劑，在無毒或弱毒情況下實(shí)現(xiàn)最佳滅蜱效果。Duscher等(2014)將傳統(tǒng)殺蜱劑氯菊酯成分與RNA干擾技術(shù)相結(jié)合，利用帶有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的雙鏈RNA干擾方法研究菊酯殺蜱機(jī)制，浸泡后的蜱在犬體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，結(jié)合雙鏈干擾后傳統(tǒng)化學(xué)制劑用量大幅降低。

2.3 飼喂法

指將飼喂用導(dǎo)管工具從蜱口器部位插入或與口器部位緊密粘合，使雙鏈RNA能夠通過導(dǎo)管從蜱口器部位進(jìn)入體內(nèi)的方法。常用的導(dǎo)管工具包括3類：巴斯德管、毛細(xì)微管(Inokumaetal., 1998)、口器套管(Lew-Taboretal., 2014)。導(dǎo)管工具微管口大小應(yīng)當(dāng)與相應(yīng)蜱種類的口器大小相當(dāng)，使得蜱口器及觸須與微管口緊密貼合，以保證體外雙鏈RNA飼喂劑能夠?qū)崿F(xiàn)最大程度的導(dǎo)入。飼喂方法起初是針對于蜱體外吸血實(shí)驗(yàn)研究，即體外對蜱直接飼喂血液。如今，Lew-Tabor等(2014)通過在對蜱飼喂血液過程中加入雙鏈RNA的方法，對蜱實(shí)現(xiàn)體外RNA干擾。當(dāng)使用動物全血作為雙鏈RNA載體時(shí)，需要加入抗凝劑，抗凝劑的不同產(chǎn)生的干擾效果也會出現(xiàn)不同，主要包括肝素、EDTA、檸檬酸鈉等。飼喂法也可直接對蟲體進(jìn)行雙鏈RNA飼喂，Soares等(2005)通過毛細(xì)小管對肩突硬蜱若蜱階段直接進(jìn)行雙鏈RNA飼喂。

飼喂法的優(yōu)點(diǎn)在于借助導(dǎo)管工具易于控制實(shí)驗(yàn)變量關(guān)系，例如雙鏈RNA濃度，增添雙鏈RNA劑量等，其操作靈活性較強(qiáng)，且成本相對較低，無需大量消耗雙鏈RNA劑量。但是，運(yùn)用飼喂法進(jìn)行RNA干擾時(shí)，關(guān)鍵在于導(dǎo)管與蜱口器是否連接粘合完整以及體外環(huán)境下蜱飲食習(xí)性是否受到影響，并且目前飼喂方法的研究局限于單宿主半飽血蜱以及部分多宿主蜱的幼蜱若蜱階段，成蜱階段及不同種類的蜱有待于進(jìn)一步研究。

這是目前一種較為理想的體外RNA干擾實(shí)驗(yàn)方法，運(yùn)用飼喂法有助于研發(fā)新型的蜱疫苗和治療藥物，有效防控蜱傳病。Inokuma等(1998)通過體外飼喂的方法研究蜱傳巴貝斯蟲傳播機(jī)制。Soares等(2005)通過飼喂雙鏈RNA，有效沉默ISAC目的基因，明顯降低蜱吸血效果。通過飼喂法進(jìn)行的RNA干擾實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明RNA干擾可以有效克服目前使用的化學(xué)殺蜱制劑污染環(huán)境缺陷。通過有效沉默功能基因、探尋保護(hù)性抗原等研究，能夠加快研制出新型殺蜱制劑。Lew-Tabor等(2014)對微小扇頭蜱使用含有雙鏈RNA的血清進(jìn)行飼喂，蜱產(chǎn)卵量與孵化率均有下降且宿主體內(nèi)免疫球蛋白含量上升，運(yùn)用飼喂法成功篩選和鑒定出蜱保護(hù)性抗原Bm86，為進(jìn)一步疫苗研制打下基礎(chǔ)。

2.4 病毒轉(zhuǎn)染法

當(dāng)某些病毒進(jìn)入蜱體細(xì)胞時(shí)，會產(chǎn)生一定量的雙鏈RNA，觸發(fā)RNA干擾途徑，根據(jù)這種現(xiàn)象而使用的RNA干擾方法稱為病毒轉(zhuǎn)染法。這種現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于多種蟲媒性病毒中，主要包括登革熱、黃熱病毒、蜱傳腦炎病毒等蟲媒性病毒(Robyetal., 2014)。Garcia等(2006)使用重組森林腦炎病毒(SFV)誘導(dǎo)ISE6蜱細(xì)胞表達(dá)小干擾RNAs(siRNAs)，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默。這種方法更適用于探索發(fā)現(xiàn)新型蜱細(xì)胞生物分子，并以病毒轉(zhuǎn)染過程為研究平臺對分子機(jī)制過程加以研究，但因其病毒個(gè)體特異性差異，且無法控制和確定雙鏈RNA劑量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性難以控制，因此不適用于實(shí)踐應(yīng)用。

在蜱研究中，利用能夠感染蜱細(xì)胞的病毒作為載體侵染蜱體細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中提供小干擾RNA成分以達(dá)到治療目的(Usme-Ciroetal., 2013)。這種方法有助于構(gòu)建蜱傳病模型，通過病毒感染與轉(zhuǎn)染，實(shí)現(xiàn)對疾病防控(Jaworskietal., 2013)。

2.5 電轉(zhuǎn)染法

指使用電轉(zhuǎn)技術(shù)，通過電壓將蜱體外合成的雙鏈RNA導(dǎo)入蜱體中，從而實(shí)現(xiàn)RNA干擾的方法。使用電轉(zhuǎn)染方法時(shí)，對雙鏈RNA提前使用熒光標(biāo)記，導(dǎo)入后可從熒光顯微鏡中進(jìn)行觀察，直觀、清晰展現(xiàn)出雙鏈RNA導(dǎo)入后在細(xì)胞內(nèi)降解mRNA變化過程。

這種方法是近幾年新出現(xiàn)的方法，最早是由Karim等(2010)報(bào)道，將電轉(zhuǎn)技術(shù)應(yīng)用于蜱雙鏈RNA傳遞過程。這種方法依賴于電轉(zhuǎn)技術(shù)相關(guān)工具，如電轉(zhuǎn)杯、電轉(zhuǎn)緩沖液等，通過這些儀器的使用，使得實(shí)驗(yàn)過程電壓強(qiáng)度與加壓時(shí)間等變量條件的摸索變得簡便。電轉(zhuǎn)法具有高通量的特點(diǎn)，在電壓作用下雙鏈RNA導(dǎo)入耗費(fèi)時(shí)間大大縮短，運(yùn)用熒光素標(biāo)記的方法對于RNA干擾機(jī)制的研究觀察較為實(shí)用，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。然而，這種方法需要準(zhǔn)備的雙鏈RNA劑量較多，成本相對較高，研究者需要對電轉(zhuǎn)技術(shù)有所了解。

目前這種方法的只應(yīng)用于蜱卵、幼蜱和部分若蜱階段，Karim等(2010)運(yùn)用電轉(zhuǎn)染的方法操作于蜱卵、幼蟲、若蟲階段和成蜱唾液腺，有效抑制目的基因的表達(dá)。

表1 目前蜱RNA干擾方法比較Tab.1 Methods to deliver dsRNA for RNA interference in ticks currently

3 結(jié)語

蜱作為重要的疫病傳播媒介，越來越受到人們的關(guān)注，而RNA干擾技術(shù)無疑為蜱學(xué)研究提供了較為理想的途徑，特別是在蜱基因功能研究、篩選和鑒定蜱的保護(hù)性抗原、蜱與蜱傳病原相互作用和創(chuàng)制新型殺蜱劑等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值(高曉等, 2010)。根據(jù)目前的研究成果，已證明多種RNA干擾方法能對蜱目的基因產(chǎn)生特異性沉默。但是，不同的RNA干擾方法有各自優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理選取，如浸泡法更適用于幼蜱若蜱階段實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染更適用于蜱細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)，顯微注射法更適用于高通量實(shí)驗(yàn)等。RNA干擾技術(shù)應(yīng)用日益成為蜱研究的熱點(diǎn)，在干擾過程中，方法學(xué)的建立起到至關(guān)重要的作用，相信隨著蜱RNA干擾研究的深入，現(xiàn)有的方法將會不斷改善更加有助于RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究，將會發(fā)現(xiàn)更多蜱功能分子，更詳盡闡明蜱發(fā)育機(jī)制，更有效防控蜱傳病，保護(hù)人畜健康，促進(jìn)旅游業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展。