汪元符

（南昌市食品藥品檢驗所，江西南昌330038）

H PLC同時測定干蟾皮中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基成分的含量

汪元符

（南昌市食品藥品檢驗所，江西南昌330038）

目的：建立干蟾皮中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基2種化學(xué)成分含量測定的高效液相色譜法。方法：采用DIKMA C18色譜柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液（30 mmol/L磷酸二氫鉀以磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0）及乙腈，梯度洗脫，柱溫為35℃，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為296 nm。結(jié)果：2種化學(xué)成分檢出限濃度均為1.0 μg/mL，定量限濃度均為2.5 μg/mL，線性范圍為2.5～100.0 μg/mL，在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，平均加樣回收率為98.8%～99.9%。結(jié)論：本方法簡便、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好、專屬性高，可用于干蟾皮中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基2種化學(xué)成分的含量測定。

高效液相色譜；干蟾皮；中華蟾酥毒基；酯蟾毒配基

干蟾皮至今未收載于歷版《中國藥典》，而見于《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1989）》、《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1993）》、《江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1996）》。干蟾皮為蟾蜍除去內(nèi)臟的干燥全體。功能與主治：清熱解毒，利水消腫；用于小兒疳積，咽喉腫痛，腫瘤；外治癰腫疔瘡。以干蟾皮為原料藥的中藥單味制劑包括：華蟾素口服液、華蟾素注射液、華蟾素片、華蟾素膠囊等，用于惡性腫瘤晚期、乙型肝炎。以干蟾皮入藥的中藥成方制劑包括：大敗毒膠囊（清熱敗毒，消腫止痛，用于梅毒及扁平疣）、鶴蟾片（解毒除痰，涼血祛瘀，消痰散結(jié)，用于原發(fā)性支氣管肺癌，肺部轉(zhuǎn)移癌）、季德勝蛇藥片（清熱解毒，消腫止痛，用于毒蛇、毒蟲咬傷）等。可見干蟾皮是一味比較常用的、重要的動物類中藥材。在現(xiàn)有的干蟾皮藥品標(biāo)準(zhǔn)中，只收載了性狀、水分（檢查項），過于簡單。本法建立干蟾皮中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基2種化學(xué)成分含量測定的高效液相色譜法（HPLC），為干蟾皮的質(zhì)量控制提供了參考。

1　儀器、試劑與材料

Waters e2695高效液相色譜儀，METTLER TOLEDOME204E電子分析天平，METTLERTOLEDO XS105電子分析天平，昆山KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，Sartorius PB-10 pH計，TG16-WS臺式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)），Millipore超純水系統(tǒng)。

甲醇（色譜純，Merck），乙腈（色譜純，Merck），磷酸（分析純，Macklin），磷酸二氫鉀（分析純，Macklin）。

對照品：華蟾酥毒基對照品（110803-200605），酯蟾毒配基（110718-201108），均由中國食品藥品檢定研究院提供。

樣品：干蟾皮10批次（批號：120406、120410、120412、120418、120610、120612、120614、121015、121016、121018），購自市場或流通企業(yè)，產(chǎn)地分別為江西、湖北、安徽、遼寧、山東、貴州、黑龍江、吉林。

2　方法與結(jié)果

2.1高效液相色譜分析條件

分析柱：DIKMA C18（250 mm×4.5 mm，5 μm）。柱溫：35℃。流速：0.8 mL/min。進(jìn)樣量：10 μL。檢測波長：296 nm。流動相：A為30 mmol/L磷酸二氫鉀（以磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0），B為乙腈。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

2.2對照品溶液的配制

取華蟾酥毒基對照品、酯蟾毒配基對照品各約10 mg，精密稱定，以甲醇制成每1 mL中各含1 mg的溶液作為對照品儲備液。取對照品儲備溶液以甲醇等比稀釋，可得到各含2.5，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0，100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

表1　梯度洗脫

2.3供試品溶液的配制

將10批樣品分別研細(xì)，各取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以10 000 r/min離心10 min后，取上清液，用0.2 μm的濾頭濾過，取續(xù)濾液測定。

2.4檢測波長的確定及專屬性試驗

按“2.2”的方法配制對照品溶液，取各含50.0 μg/mL的混合對照品溶液試驗。按“2.3”的方法制備供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液。分別取混合對照品溶液、試劑空白溶液、供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液，按“2.1”項下的條件檢測。結(jié)果見圖1～6。其中華蟾酥毒基對照峰保留時間為22.644 min，酯蟾毒配基對照峰保留時間為23.726 min。

由各成分的紫外吸收光譜圖可知，華蟾酥毒基的最大吸收波長為294.0 nm，酯蟾毒配基的最大吸收波長為298.7 nm，選擇檢測波長為296 nm時，華蟾酥毒基、酯蟾毒配基都能得到較好的檢測靈敏度。

由混合對照品溶液、試劑空白溶液、供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液所采集的色譜圖比較可知，試劑空白及供試品對各成分的檢測無干擾，各成分峰均能基線分離，分離度（R）均在2.0以上，實測理論塔板數(shù)均在4 000以上。

圖1　試劑空白296 nm波長采集色譜圖

圖2　混合對照296 nm波長采集色譜圖

圖3　在22.644 min及23.726 min提取的華蟾酥毒基、酯蟾毒配基對照紫外吸收光譜圖

圖4　供試品296 nm波長采集色譜圖

2.5線性關(guān)系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”項下的色譜條件，以“2.2”項下的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣檢測。以檢測所得峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。以采集的色譜圖中檢出峰的信噪比大于3時的濃度（μg/mL）為檢出限，信噪比大于10時的濃度（μg/mL）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于0.99，為線性范圍。結(jié)果如表2。

圖5　在22.778 min及23.842 min提取的華蟾酥毒基、酯蟾毒配基紫外吸收光譜圖

圖6　供試品加標(biāo)296 nm波長采集色譜圖

表2　2種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線測定、檢出限和定量限檢測

2種成分在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限均為1.0 μg/mL，定量限均為2.5 μg/mL，靈敏度較高。

2.6精密度試驗

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，計算各成分峰面積的相對偏差。結(jié)果如表3，各成分RSD值在0.04%～0.05%之間，精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣，以各成分峰面積計算。結(jié)果如表4，各成分RSD值在0.46%～1.06%之間，表明24 h內(nèi)能穩(wěn)定檢測。

表3　2種成分精密度檢測結(jié)果

表4　2種成分穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.8重復(fù)性試驗

選用批號為120406的干蟾皮，按“2.3”項下的方法制備6份平行樣品，按本法檢測其中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量。結(jié)果如表5，各成分RSD值在0.15%～0.34%之間，表明重復(fù)性良好。

表5　2種成分重復(fù)性檢測結(jié)果

2.9回收率試驗

取批號為120406的干蟾皮（華蟾酥毒基0.134 7 mg/g，酯蟾毒配基0.087 4 mg/g）試驗。準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品，按“2.3”項的方法制備供試液，2種成分理論濃度為：華蟾酥毒基2.69 μg/mL，酯蟾毒配基1.75 μg/mL。分別準(zhǔn)確加入0.125，2.500，4.500 mL各含1 mg/mL的對照品儲備液，再按“2.3”項的方法制備成供試液，2種成分理論加入濃度各為：2.5，50.0，90.0 μg/mL；加入后的理論加標(biāo)濃度應(yīng)為：華蟾酥毒基5.19，52.69，92.69 μg/mL，酯蟾毒配基4.25，51.75，91.75 μg/mL。以5次平行測定結(jié)果的均值與加標(biāo)濃度相比較，回收率如表6所示，2種成分高、中、低3個濃度的回收率均在99.3%～99.7%之間。

表6　干蟾皮中加樣回收試驗

2.10樣品測定結(jié)果

檢測了10批干蟾皮，結(jié)果如表7所示。

3　討論

3.1液相色譜條件的選擇

參照《中國藥典》2010年版一部“蟾酥”含量測定項下的色譜譜條件：以乙腈-0.5%磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.2）為流動相，檢測波長296 nm，柱溫40℃。采集的混合對照品色譜圖如圖7所示。結(jié)果2種成分對照品峰不能分離，需要對液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。

表7　干蟾皮中2種成分測定（mg/g）

試采用梯度洗脫的方式，結(jié)果2種成分對照品峰能夠完全分離，而且能大大提高柱效（n＞4 500）。因此采用了本法梯度洗脫的方式。

圖7　混合對照296 nm波長采集色譜圖

流動相試用了磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸鹽緩沖液-甲醇系統(tǒng)，結(jié)果以磷酸鹽緩沖液-乙腈系統(tǒng)分離效率高，峰型好，柱效高。但高于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液濃度與乙腈混合，很有可能產(chǎn)生鹽析，危害色譜系統(tǒng)，所以采用本法的30 mmol/L，以保護(hù)色譜系統(tǒng)。

流動相pH值的選擇：所測的2種成分化合物在酸性條件下分離較好，試用了pH值為3.0，4.0，5.0等不同pH值的磷酸鹽緩沖液，結(jié)果表明在pH值為3.0時，分離最好，柱效最高。

柱溫的選擇：在其他條件不變的前提下，試用不同的柱溫：25，35，40℃。結(jié)果顯示，柱溫40℃時柱效反而不如柱溫25℃。但柱溫35℃與柱溫25℃柱效相當(dāng)。因此選用本法的條件，柱溫35℃。

流動相流速的選擇：考察了0.8 mL/min和1.0 mL/min兩個流速下的色譜圖。結(jié)果顯示在0.8 mL/min流速下的柱效及分離優(yōu)于1.0 mL/min的流速。因此選用本法的條件，流速0.8 mL/min。

3.2供試品提取方法選擇

曾試用不同提取溶劑：甲醇、50%甲醇、乙腈、50%乙腈、乙醇、50%乙醇。結(jié)合不同提取方式：超聲、索氏回流。結(jié)果表明，甲醇提取效率最高，且超聲與索氏回流無明顯差異，可以選用甲醇超聲提取的方式。

考察了不同的超聲時間：15，20，30，45 min。結(jié)果表明15 min提取不夠完全，20，30，45 min提取時間的提取結(jié)果沒有明顯差異。因此，本法選用了30 min的提取時間。

以取樣量2.0 g，考察了不同提取溶劑體積：10，25，50 mL對提取結(jié)果的影響。結(jié)果表明10 mL甲醇提取不夠完全，25，50 mL甲醇提取結(jié)果沒有明顯差異。因此，本法選用了50 mL甲醇的提取體積。

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Simultaneous Determination of Cinobufagin and Resibufogenin in Dried Toad Skin by HPLC

Wang Yuanfu
（Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

ABSTRACRObjective：To develop a HPLC method for determination of two components，cinobufagin and resibufogenin，in dried toad skin.Methods：DIKMA C18column（250 mm×4.5 mm，5 μm）was used，with phosphate buffer solution（30 mmol/L potassium dihydrogen，of which the pH value was adjusted to 3.0 with phosphoric acid）-acetonitrile as a mobile phase for gradient elution at a column temperature of 35℃and a flow rate of 0.8 mL/min.The sample loading was 10 μL，and the detection wavelength was 296 nm.Results：Both the detection limits of the two components were 1.0 μg/mL，while the quantitative detection limits were 2.5 μg/mL，the linear ranges were 2.5～100 μg/mL（r＞0.99），and the recovery rates were 98.8%～99.9%.Conclusion：The HPLC method is simple，accurate，rapid，and of a good reproducibility and a high specificity，which may be used for simultaneous determination of cinobufagin and resibufogenin in toad skin.

High Performance Liquid Chromatography（HPLC）；Dried Toad Skin；Cinobufagin；Resibufogenin

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.12.005

2015-08-09）

汪元符，男，主管藥師。研究方向：中藥理論、藥物檢測及食品安全。E-mail：wanngel@126.com