龍燕 王葉芳

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥理教研室，江蘇南京 210009；2.南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，江蘇南京 210014）

麻杏石甘湯對(duì)肺炎支原體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

龍燕1王葉芳2

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥理教研室，江蘇南京 210009；2.南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，江蘇南京 210014）

目的：觀察麻杏石甘湯對(duì)肺炎支原體（MP）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法：培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW246.7，分別將麻杏石甘湯1、5、10、20μL與巨噬細(xì)胞共孵育，模型組與空白對(duì)照組分別加入磷酸鹽緩沖液（PBS）20μL與細(xì)胞共孵育。除空白對(duì)照組，72h后利用滅活MP感染其余各組細(xì)胞24h。通過(guò)MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活力，LDH檢測(cè)細(xì)胞損傷率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），LDH釋放、細(xì)胞凋亡百分比顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯10μL與20μL組細(xì)胞活力顯著提高（P＜0.05），LDH釋放、細(xì)胞凋亡百分比顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：麻杏石甘湯能對(duì)抗MP引起的RAW246.7細(xì)胞活力下降，抑制MP誘導(dǎo)的RAW246.7細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。

麻杏石甘湯 巨噬細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞活力 體外實(shí)驗(yàn)

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童呼吸道感染較常見(jiàn)的病原體，其發(fā)病率在嬰幼兒中有逐年升高的趨勢(shì)。麻杏石甘湯是辨證治療痰熱閉肺型肺炎支原體肺炎（mycoplasmal pneumoniae pneumonia，MPP）的常用方劑，經(jīng)臨床驗(yàn)證療效確切［1］。課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯可降低MP感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白水平的表達(dá)［2］。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW246.7細(xì)胞株，給予麻杏石甘湯預(yù)孵育后感染滅活MP，觀察細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡水平的變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品、菌株與試劑MP菌株29342（ATCC，M129-B7）。麻杏石甘湯，藥物組成：麻黃、杏仁、石膏、甘草（1∶3∶6∶2），內(nèi)含生藥0.36g/mL，由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供。DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibcol，USA）；胎牛血清（Gibcol，USA）；3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，sigma-Aldrich，USA）；二甲基亞砜（DMSO，Gibcol，USA）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物制品有限公司）；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（thermo，USA）。

1.2 儀器DG3033A型酶聯(lián)免疫儀（華東電子管廠）；XSZ-D倒置生物顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；BB-16型二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus），XIDP超凈工作臺(tái)（蘇州吳縣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物儀器廠）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MP菌株培養(yǎng)MP菌株培養(yǎng)于支原體肉湯培養(yǎng)基中。解凍培養(yǎng)基至溶液變黃時(shí)進(jìn)行MP菌落培養(yǎng)，約12d形成荷包蛋樣菌落，隨機(jī)挑取一個(gè)菌落加入支原體肉湯后，37℃5%CO2，800r/min×72h培養(yǎng)，收集菌液，調(diào)整濃度至106～107CFU/mL。

2.2 巨噬細(xì)胞RAW246.7培養(yǎng)及分組DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW246.7細(xì)胞株，待細(xì)胞密度達(dá)到60%后，將細(xì)胞接種于96與24孔板內(nèi)，并分為以下組別：空白對(duì)照組，加入20μL磷酸鹽緩沖液（PBS）；模型組，給予20μL PBS，72h后加入滅活MP（滅活條件：將MP菌株暴露于紫外線中2h）10μL；麻杏石甘湯各劑量給藥組，分別以麻杏石甘湯1、5、10、20μL與細(xì)胞共孵育72h后，給予滅活MP菌株。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)培養(yǎng)24h后，各組采用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，LDH試劑盒檢測(cè)LDH水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

2.3.1 細(xì)胞活力測(cè)定（MTT法）MTT可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原成難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞體內(nèi)，但是死亡細(xì)胞內(nèi)的MTT不能被還原。DMSO可以溶解這些紫色結(jié)晶，通過(guò)測(cè)定570nm波長(zhǎng)下吸光度不同，可以檢測(cè)細(xì)胞活力。配制MTT至終濃度為5mg/mL工作液。向96孔板每孔加入50μL MTT工作液。待反應(yīng)4h后，吸去上清液（注意避免吸走甲瓚結(jié)晶），每孔加入200μL的DMSO，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，以DMSO調(diào)零，測(cè)定570nm處的光密度值（OD），以空白對(duì)照組的OD值為100%，計(jì)算各給藥組RAW246.7細(xì)胞活力。

2.3.2 LDH活性測(cè)定及抑制率計(jì)算收集24孔板內(nèi)每孔培養(yǎng)液0.5mL，按照乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)的步驟，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液的LDH活性，再根據(jù)下式計(jì)算各組LDH抑制率。

LDH抑制率=（模型組LDH含量-給藥組LDH含量）/（模型組LDH含量-空白對(duì)照組LDH含量）

2.3.3 Annexin V與PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)，PBS洗滌細(xì)胞后，用雙蒸水1∶4稀釋結(jié)合緩沖液，以稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并調(diào)細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，取195μL細(xì)胞懸液，加5μL Annexin V-FITC和10μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)30min，上機(jī)檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Stata（Version 10.0，Stata-Corp，LP）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用的分析方法為單因素方差分析及兩兩比較（Scheffe test），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，MP感染RAW246.7細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞活力顯著下降，細(xì)胞外LDH釋放顯著上升，細(xì)胞凋亡率顯著增高；與模型組相比，麻杏石甘湯10μL與20μL組細(xì)胞活力顯著上升，細(xì)胞外LDH釋放顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著降低。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞活力、細(xì)胞外LDH含量及LDH抑制率、細(xì)胞凋亡率比較

圖1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖譜

4 討論

支原體肺炎發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，現(xiàn)認(rèn)為感染后MP與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用，導(dǎo)致多克隆促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞增殖，激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞與細(xì)胞毒T細(xì)胞的溶細(xì)胞活力，刺激淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，造成組織損傷［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道，呼吸道MP感染患者血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平明顯增高［4］。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可明顯促進(jìn)白介素8（IL-8）含量升高，而IL-8可趨化白細(xì)胞至炎癥部位，加重組織損傷；亦可通過(guò)T細(xì)胞、B細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性及非特異性免疫功能，誘導(dǎo)中心粒細(xì)胞的趨化作用和局部浸潤(rùn)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，降低細(xì)胞跨膜電位，誘發(fā)其他炎性介質(zhì)釋放；高水平TNF-α可促進(jìn)B細(xì)胞合成過(guò)多的IgE，使機(jī)體出現(xiàn)高敏狀態(tài)和I型變態(tài)反應(yīng)［5-8］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，MP可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡［9］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MP可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞活力顯著下降，細(xì)胞外LDH活力顯著上升。LDH是機(jī)體能量代謝中的一種重要酶，主要存在于細(xì)胞內(nèi)，屬胞漿酶，細(xì)胞破裂時(shí)LDH釋放到基質(zhì)中，測(cè)定LDH活性可以推斷細(xì)胞損傷程度。不同體積的麻杏石甘湯預(yù)處理細(xì)胞后，10μL及20μL麻杏石甘湯可顯著降低由MP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡率，提高細(xì)胞活力并同時(shí)降低細(xì)胞外LDH活力，但麻杏石甘湯1μL及5μL未顯示出對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，這可能由于麻杏石甘湯有效濃度過(guò)低所致。上述結(jié)果提示，MP可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，麻杏石甘湯則對(duì)巨噬細(xì)胞具有保護(hù)作用。吞噬清除損傷細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的重要生理功能，同時(shí)巨噬細(xì)胞可釋放大量TNF-α參與調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫。因此，當(dāng)機(jī)體感染MP后，在疾病的后期由于大量巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞內(nèi)大量TNF-α被釋放至細(xì)胞外，炎癥加重。而麻杏石甘湯通過(guò)抑制MP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，提高巨噬細(xì)胞活力，是其能夠有效輔助治療MP的主要機(jī)制之一。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，麻杏石甘湯的有效濃度與其對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用有相關(guān)性，但是否在輔助治療MP感染時(shí)，麻杏石甘湯濃度越高其療效就越好仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。并且，麻杏石甘湯通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞凋亡仍需深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為麻杏石甘湯通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫達(dá)到輔助治療MP提供了有力證據(jù)，且由于其對(duì)巨噬細(xì)胞具有保護(hù)作用，可推測(cè)麻杏石甘湯在其他炎癥疾病中也可能發(fā)揮有效治療作用。

［1］曾軍文.中西醫(yī)結(jié)合治療小兒肺炎支原體肺炎100例.江西中醫(yī)藥，2007，38（7）：63

［2］王葉芳，王艷波，邊遜.麻杏石甘湯對(duì)幼齡大鼠肺炎支原體肺炎的輔助治療及相關(guān)機(jī)制研究.江蘇中醫(yī)藥，2013，45（11）：69

［3］Ngeow YF，Suwanjutha S，ChantarojanasrirI T，et al.An Asian study on the prevalence of a typical respiratory pathogens in community-acquired pneumonia1.Int J Infect Dis，2005，9（3）：144

［4］袁紅瑛，于芳，張青曉，等.肺炎支原體感染患兒血清腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素6及8變化.實(shí)用兒科臨床雜志，2003，18（9）：749

［5］Mcmasters KM，Cheadle WG.Regulation of macrophage TNFalpha，IL-1beta，andIa（I-Aalpha）mRNA expression during peritonitis is site dependent.J Surg Res，1993，54（5）：426

［6］Eleftheriadis T，Antoniadi G，Liakopoulos V，et al.Paricalcitol reduces basal and lipopolysaccharide-induced（LPS）TNF-alphaandIL-8productionbyhuman peripheral blood mononuclear cells.Int Urol Nephrol，2010，42（1）：181

［7］Kim EJ，Bu SY，Sung MK，et al.Analysis of Antioxidant and Anti-inflammatory Activity of Silicon in Murine Macrophages.Biol Trace Elem Res，2013，156（1-3）：329

［8］Eysink PE，Terriet G，Aalberse RC，et al.Accuracy of specific IgE in the prediction of asthma:development of a scoring formula for general practice.Br J Gen Pract，2005，55（511）：125

［9］朱翠明，汪世平，游曉星，等.肺炎支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2012，20（9）：773

編輯：吳寧

R289.51

A

1672-397X（2015）10-0074-03

龍燕（1978—），女，博士，講師，主要研究方向：藥理學(xué)及神經(jīng)生物學(xué)。

王葉芳，本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師。wangyefang@126.com

2015-07-01