夏曉華 夏曉培 董慧 等

摘要：以泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）為試驗(yàn)對象，通過急性毒性試驗(yàn)、單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（彗星試驗(yàn)）、酶活測定來檢測除草劑乙氧氟草醚對泥鰍肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)，從而研究了乙氧氟草醚對水生生物的毒性。結(jié)果表明，乙氧氟草醚對泥鰍的24、48、72、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度（LC50）分別為36.67、32.87、28.38、27.40 mg/L，安全濃度為7.92 mg/L。彗星試驗(yàn)各試驗(yàn)組中，濃度越高，細(xì)胞的拖尾越嚴(yán)重，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)。低濃度乙氧氟草醚處理（8、12 mg/L）對泥鰍肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）具有誘導(dǎo)作用，而長時(shí)間（6 d）的高濃度乙氧氟草醚處理（16、20 mg/L）則具有抑制作用，試驗(yàn)組與對照組存在顯著或極顯著差異。

關(guān)鍵詞：乙氧氟草醚；泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）；半致死質(zhì)量濃度；單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)；GPT；GOT

中圖分類號：S948 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5092-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.042

Toxic Effects of Oxyfluorfen on Liver of Misgurnus anguillicaudatus

XIA Xiao-hua，XIA Xiao-pei，DONG Hui，LU Chen-hua，XU Pei-fang，DU Qi-yan，CHANG Zhong-jie

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： Loach as test object， by acute toxicity test， single cell gel electrophoresis （cometassay）， enzyme activity assay to detectd oxyfluorfen fluorine grass ethers of loach liver cell toxicity effect. The toxicity of oxyfluorfen to aquatic organisms were studied. The results showed that， half of oxyfluorfen on the 24，48，72，96 h lethal concentration（LC50） were 36.67，32.87，28.38， 27.40 mg/L， safe concentration for 7.92 mg/L. The experimental group， the higher concentration， the cell smearing more serious， also presents the obvious time dose effect. The activities of GPT and GOT in liver were induced by the lower concentration treatments（8，12 mg/L）， but restrained by the longer time（6 d） and higher concentration treatments （16，20 mg/L）. Experimental groups were significant difference or very significant difference in comparison with the control group. The results showed that the oxyfluorfen has a strong toxicity to Misgurnus anguillicaudatus.

Key words： oxyfluorfen； Misgurnus anguillicaudatus； lethal concentration；comet assay； GPT； GOT

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），隸屬鰍科花鰍亞科泥鰍屬，是一種抗污能力較強(qiáng)的淡水魚[1]，其肉質(zhì)佳、味道美，是老百姓餐桌上一道不可缺少的大餐。泥鰍可以適應(yīng)多種混合養(yǎng)殖，最為常見的泥鰍養(yǎng)殖模式為稻鰍共作的嵌套種養(yǎng)模式。稻田間噴灑的農(nóng)藥，一部分作用于農(nóng)作物水稻上，一部分散落在下層水體環(huán)境中影響嵌套養(yǎng)殖的泥鰍，而且殘留的除草劑還有可能通過食物鏈進(jìn)入人和牲畜的體內(nèi)，不易降解，最終通過逐漸積累對人畜的機(jī)體造成損害。

乙氧氟草醚（Oxyfluorfen）又名氟硝草醚、果爾、割草醚，化學(xué)分子式為C15H11CF3NO4，含氟二苯醚類[2]，是一種高效的、水旱田兼用的、廣譜的、苗前苗后觸殺型除草劑[3]。近年來，許多專家學(xué)者對乙氧氟草醚的分析方法、藥效試驗(yàn)、殘留動態(tài)等開展了較為系統(tǒng)的研究[4-6]，而有關(guān)稻鰍嵌套種養(yǎng)過程中，其對泥鰍的毒性研究尚未見報(bào)道。單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)又稱為“彗星電泳”，是一種在單個(gè)細(xì)胞水平上檢測真核細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)的方法，具有靈敏度高、迅速、簡便、經(jīng)濟(jì)及所需細(xì)胞少等優(yōu)點(diǎn)[7]。谷草轉(zhuǎn)氨酶（簡稱GOT、AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（簡稱GPT、ALT）是臨床上檢驗(yàn)肝功能是否正常的重要指標(biāo)，可用來判斷肝臟是否受到損害。本研究通過研究乙氧氟草醚對泥鰍肝細(xì)胞DNA損傷以及對其肝臟GPT和GOT活性的影響，旨在為乙氧氟草醚的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

泥鰍100尾，購自新鄉(xiāng)市海鴻農(nóng)貿(mào)市場，體量13～16 g/尾，體長9～12 cm。試驗(yàn)前用曝氣3 d的自來水馴養(yǎng)一周，馴養(yǎng)期間死亡率小于2%，挑選健康活潑和體表無損的個(gè)體作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)前1 d停止喂食，進(jìn)行饑餓處理，試驗(yàn)期間不投喂。曝氣自來水48 h以上，水溫11～23 ℃，溶解氧5～6 mg/L，pH 6.9～7.2。

乙氧氟草醚制劑購自新鄉(xiāng)市東海農(nóng)資市場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn) 通過預(yù)試驗(yàn)確定最大零致死質(zhì)量濃度和最小全致死質(zhì)量濃度。本研究設(shè)20.83、25.00、30.00、36.00、43.20 mg/L 5個(gè)等比濃度梯度試驗(yàn)組和1個(gè)空白對照組，每組投放10尾泥鰍，每24 h更換1次等體積等濃度的乙氧氟草醚，試驗(yàn)開始后12 h連續(xù)觀察，記錄其中毒癥狀以及24、48、72及96 h的死亡數(shù)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

采用改進(jìn)寇氏法（Karber）[8，9]計(jì)算乙氧氟草醚對泥鰍的半數(shù)致死質(zhì)量濃度LC50，其計(jì)算公式為LgLC50=Xm-i（∑p-0.5），安全濃度SC的計(jì)算公式：SC=LC50（48 h）×0.3/[LC50（24 h）/LC50（48 h）]2。

式中，Xm為死亡組最大劑量的對數(shù)；i為相鄰組濃度對數(shù)之差；p為各組的死亡率，∑p為各組死亡率的總和。

1.2.2 彗星試驗(yàn) 在急性試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，在安全濃度和最大零致死質(zhì)量濃度之間，設(shè)8、12、16、20 mg/L 4個(gè)處理組和1個(gè)空白對照組，每組隨機(jī)投放20尾泥鰍，每24 h更換1次等體積等濃度的乙氧氟草醚。分別設(shè)置2、4、6 d 3個(gè)時(shí)間區(qū)段組，每次每個(gè)時(shí)間每個(gè)濃度取2尾制備肝細(xì)胞懸液，試驗(yàn)步驟參照陳忻等[10]的方法進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 酶活測定 處理組與彗星試驗(yàn)相同。試驗(yàn)開始后每組每2 d隨機(jī)取2尾泥鰍，取出肝臟，各按1∶99加入魚用生理鹽水進(jìn)行研磨，制成1%勻漿。將勻漿移入2個(gè)離心管中， 2 500 r/min離心10 min，用于谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活力和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活力的測定，然后計(jì)算泥鰍GPT、GOT活力的平均值。GPT和GOT勻漿活力分別用谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（賴氏法）和谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（賴氏法）測定，用BCA法測定組織蛋白質(zhì)含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)運(yùn)用CASP彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析，得出彗星尾部DNA百分含量（Tail DNA）、彗星尾部長度（Tail length，TL）、Olive尾矩（Olive tail moment，OTM）3項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

肝細(xì)胞酶活試驗(yàn)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析，并用SPSS 13.0軟件進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙氧氟草醚對泥鰍的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的乙氧氟草醚對泥鰍活動的影響有明顯的差別。在低劑量組（20.83、25.00 mg/L）中，泥鰍基本上沒有出現(xiàn)異常的行為變化。但在高劑量組（36.00、43.20 mg/L）中，泥鰍不斷地快速游動，有時(shí)狂游躍出水面，最終逐漸失去游動能力，翻白肚直至死亡。不同質(zhì)量濃度的乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍的急性試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，乙氧氟草醚對泥鰍24、48、72、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度（LC50）分別為36.67、32.87、28.38、27.40 mg/L，安全質(zhì)量濃度為7.92 mg/L。

2.2 乙氧氟草醚對泥鰍肝細(xì)胞DNA損傷試驗(yàn)結(jié)果

單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果表明，對照組細(xì)胞核均呈現(xiàn)圓球形，彗星頭部DNA致密且集中。隨著濃度的增加，各處理組細(xì)胞核呈現(xiàn)彗星樣，彗星頭部逐漸縮小，發(fā)散程度增加（圖1）。

利用彗星圖像分析軟件CASP及統(tǒng)計(jì)軟件SPSS對各濃度組彗尾DNA所占百分含量（Tail DNA）、尾長（TL）和Olive尾距（OTM）3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測量，結(jié)果見表2。在2 d肝細(xì)胞組中，泥鰍的彗尾DNA含量、尾矩、尾長均隨著濃度的增加而增大，與對照組相比差異極顯著（P<0.01），并在20 mg/L時(shí)達(dá)到峰值。肝細(xì)胞彗尾DNA含量為（22.54±3.67）%，尾長為（187.00±22.63）%，尾矩為（21.45±5.12）%，表明在處理時(shí)間為2 d的情況下，隨著乙氧氟草醚濃度的增加，對泥鰍細(xì)胞的DNA損傷也越嚴(yán)重。在4 d肝細(xì)胞組中，試驗(yàn)結(jié)果所呈現(xiàn)的趨勢大致與2 d組相同，且3項(xiàng)指標(biāo)在20 mg/L中同樣也達(dá)到峰值，與對照組相比差異極顯著（P<0.01），并且較2 d組而言，3項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值都有了大幅度的提升，表明乙氧氟草醚對泥鰍肝細(xì)胞DNA的損傷有時(shí)間劑量效應(yīng)，達(dá)到峰值時(shí)肝細(xì)胞彗尾DNA含量為（31.71±1.95）%，尾長為（231.00±9.90）%，尾矩為（43.24±3.14）%。

2.3 乙氧氟草醚對泥鰍肝細(xì)胞酶活的影響試驗(yàn)結(jié)果

乙氧氟草醚處理后對泥鰍肝臟GPT及GOT活力的影響試驗(yàn)結(jié)果見表3。不同濃度乙氧氟草醚處理2 d和4 d，均導(dǎo)致泥鰍肝臟中的GPT與GOT活性升高，20 mg/L乙氧氟草醚處理4 d后均達(dá)到最大，分別為40.20、46.04 U/g。處理6 d后，GPT與GOT活性均有所下降。

3 小結(jié)與討論

本研究以泥鰍為試驗(yàn)材料，參照2009年新版《國際危規(guī)》分類標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)將化學(xué)物質(zhì)對魚類的毒性分為3個(gè)等級[11]，當(dāng)96 h的LC50大于10 mg/L時(shí)屬于低毒。本試驗(yàn)中乙氧氟草醚對泥鰍的96 h的半致死質(zhì)量濃度為27.40 mg/L，表明乙氧氟草醚對泥鰍的毒性屬于低毒。

單細(xì)胞凝膠電泳與經(jīng)典的染色體畸變、微核相比，適用于研究低劑量及高劑量下的生物效應(yīng)、活細(xì)胞及死亡細(xì)胞DNA的檢測，非常適用于評價(jià)受試物的遺傳毒性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著乙氧氟草醚濃度的增加和處理時(shí)間的延長，彗尾DNA、尾長、尾矩均逐漸增大，在處理時(shí)間為6 d，濃度為16 mg/L時(shí)達(dá)到最大[彗尾DNA為（46.21±1.40）%，尾長為（314.00±25.46）%，尾矩為（124.62±10.01）%]，說明此時(shí)的DNA損傷最嚴(yán)重，在20 mg/L濃度組中，3個(gè)指標(biāo)均出現(xiàn)一定程度地下降，說明此時(shí)DNA的損傷程度有所緩解。推測可能的原因有兩種：一種是與DNA自身的修復(fù)機(jī)制有關(guān)，DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，啟動SOS修復(fù)機(jī)制，使DNA的損傷程度減輕，使得拖尾現(xiàn)象不明顯；二是高濃度、長時(shí)間處理以后，DNA受損傷過大以致彗星電泳時(shí)DNA片段分散太開，在鏡檢時(shí)形成的彗星尾部熒光信號太弱，故呈現(xiàn)出測量值下降的表象[12]。

GPT和GOT是肝臟中活性最強(qiáng)的兩種轉(zhuǎn)氨酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起著重要的作用，其活性變化與肝細(xì)胞的炎癥、變性和壞死等密切相關(guān)[13]，是肝細(xì)胞受損最靈敏的指標(biāo)。肝臟是重要的解毒器官，能夠?qū)⒂卸镜奈镔|(zhì)最終轉(zhuǎn)換為尿素排出體外。本研究測定了不同濃度乙氧氟草醚在不同時(shí)間處理下，泥鰍肝臟中GPT和GOT的活性變化。結(jié)果表明，在低濃度短時(shí)間的處理?xiàng)l件下，肝臟GPT和GOT活性均較對照組有了明顯的升高，說明乙氧氟草醚在較低濃度下短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)GPT和GOT活性顯著升高，加強(qiáng)機(jī)體對毒物的代謝；但是在處理時(shí)間延長為6 d的較高濃度組中（16、20 mg/L），這2種酶的活性開始降低，甚至低于空白對照，表現(xiàn)出非常明顯的抑制效應(yīng)。這可能是由于長期處于脅迫作用下，泥鰍肝細(xì)胞受到一定程度的損傷，其功能開始下降。

綜上所述，本研究表明一定濃度的乙氧氟草醚能夠造成泥鰍肝細(xì)胞DNA的損傷，并且影響肝臟轉(zhuǎn)氨酶的活性，為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中合理使用除草劑，提高泥鰍產(chǎn)量，更好地發(fā)揮嵌套養(yǎng)殖的優(yōu)勢提供依據(jù)。

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