趙 振 韋廣粵

1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生院，桂林 541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，桂林 541004

法舒地爾對(duì)膿毒癥所致急性肺損傷及肺組織中HMGB1表達(dá)的影響

趙 振1韋廣粵2▲

1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生院，桂林 541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，桂林 541004

目的觀察法舒地爾對(duì)小鼠膿毒癥所致急性肺損傷的影響及其使用與否對(duì)肺組織中HMGB1表達(dá)量的影響。 方法將48只BALB-C小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）組、法舒地爾預(yù)處理組，在6、24 h時(shí)間點(diǎn)取血、肺泡灌洗液及鼠肺用于結(jié)果分析。 結(jié)果在6、24 h時(shí)間點(diǎn)，法舒地爾可以顯著降低CLP所致的小鼠血清中TNF-α及HMGB1和肺泡灌洗液中蛋白濃度的增加。除此之外，法舒地爾預(yù)處理還可以逆轉(zhuǎn)CLP誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理形態(tài)改變。同時(shí)，法舒地爾能減少CLP所致小鼠肺組織中HMGB1mRNA表達(dá)量的增加。結(jié)論法舒地爾能減輕CLP小鼠所致的肺損傷并降低肺組織中HMGB1的表達(dá)。

法舒地爾；膿毒癥；急性肺損傷；Rho激酶；HMGB1

革蘭氏陰性菌引起的膿毒癥仍然是導(dǎo)致急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的常見(jiàn)原因之一［1］，其主要機(jī)制是細(xì)菌內(nèi)毒素釋放進(jìn)入血液循環(huán)，激活肺的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺損傷［2-3］。炎性介質(zhì)的產(chǎn)生在肺損傷的病理生理機(jī)制中起重要的作用。法舒地爾作為一種特異的Rho激酶抑制劑，在臨床上主要應(yīng)用于治療腦血管痙攣，改善腦組織微循環(huán)等［4-7］，然而隨著對(duì)Rho激酶的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其是一種參與多種細(xì)胞功能的重要分子開(kāi)關(guān)，并且其抑制劑可減少NF-κB活化，大大減少促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，從而使TNF-α，IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)減少［8-9］。目前對(duì)其抗炎作用的研究多集中在炎癥早期。高遷移率族蛋白1（HMGB1）作為一個(gè)重要的炎癥介質(zhì)，在內(nèi)毒素血癥晚期被釋放。HMGB1在血清中的水平與膿毒癥患者的死亡率呈正相關(guān)［10］，因此本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)探討法舒地爾對(duì)膿毒癥肺組織中HMGB1表達(dá)的影響，完善法舒地爾治療膿毒癥所致肺損傷可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)BALB-C小鼠，48只，雌雄不拘，體重25～30 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

酶標(biāo)儀、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、光學(xué)顯微鏡、鹽酸法舒地爾注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)1106021）、小鼠HMGB1 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）、TRIzon總RNA提取試劑 （北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒（Thermo，美國(guó)）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.3 CLP肺損傷模型制備及分組

48只BALB-C小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（NS組，n=16）、盲腸結(jié)扎穿刺組（CLP組，n=16）、法舒地爾（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)1106021）預(yù)處理組（FAS組，n=16）。其中按處死時(shí)間不同分為NS 6 h組，NS 24 h組；CLP 6 h組，CLP 24 h組；FAS 6 h組，F(xiàn)AS 24 h組6個(gè)亞組，每組8只。FAS組在造模前18 h和30min腹腔注射法舒地爾10mg/kg，NS組和CLP組給予等量的生理鹽水。CLP組和FAS組使用水合氯醛麻醉后，腹部備皮，取正中切口，確定盲腸位置后游離周圍血管，盲腸末端1 cm處4號(hào)線結(jié)扎盲腸，7號(hào)穿刺針在遠(yuǎn)心端穿刺，擠出少許糞便后，將盲腸還納腹腔，縫皮。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 小鼠取血處死后，立即開(kāi)胸，結(jié)扎一側(cè)肺組織，沿主支氣管注入0.7 ml，10%甲醛溶液后結(jié)扎該側(cè)支氣管放入甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織的病理形態(tài)變化。

1.4.2 血清TNF-α、HMGB1檢測(cè) 小鼠摘取眼球取血0.8ml，常溫靜置30min～2 h，以3900 r/min離心25min，取上清放置于-20℃冰箱內(nèi)保存，使用ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清TNF-α、HMGB1濃度。

1.4.3 肺泡灌洗液總蛋白濃度測(cè)定 小鼠處死后，做頸部切口，游離小鼠氣管，以生理鹽水進(jìn)行灌洗，回收灌洗液，3000 r/min離心25min，離心后取上清液放置于-20℃冰箱內(nèi)保存，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定肺泡灌洗液總蛋白濃度。

1.4.4 肺組織HMGB1 mRNA的表達(dá) 無(wú)菌取一側(cè)小鼠肺組織，TRIzon法提取細(xì)胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參。小鼠HMGB1引物序列（擴(kuò)增片段為174 bp）：5'-CGGATGCTTCTGTCAACTTC-3'（前引物）；5'-TGAACTTCTTTTTGGTCTCC-3'（后引物）。小鼠β-actin引物序列（擴(kuò)增片段為445 bp）：5'-GAGGGAAATC GTGCGTGAC-3'（前引物）；5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3'（后引物）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行照相并測(cè)定光密度值，以目的基因與內(nèi)參光密度值的比值作為基因表達(dá)的相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物的一般情況

CLP組的小鼠在手術(shù)后活動(dòng)能力下降明顯、精神萎靡、呼吸急促、厭食；24 h組可出現(xiàn)豎毛、毛發(fā)光澤度下降、眼周分泌物增多、對(duì)外界反應(yīng)淡漠。6 h組處死后解剖可見(jiàn)腸管明顯擴(kuò)張、腸系膜充血。24 h組處死后解剖可見(jiàn)上述表現(xiàn)進(jìn)一步加劇且可見(jiàn)血性或膿性腹水，帶臭味。肝大明顯。FAS組亦出現(xiàn)上述癥狀，不過(guò)較CLP組輕微，其中24 h組改善較明顯。NS組小鼠如常，無(wú)相應(yīng)表現(xiàn)。

2.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

光鏡下可見(jiàn)，NS組小鼠肺組織為正常肺組織，結(jié)構(gòu)清晰完整未見(jiàn)水腫，僅可見(jiàn)有少量炎性細(xì)胞。CLP組可見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡萎陷，小鼠的肺中有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，血管充血和出血。FAS組中小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，雖也可見(jiàn)肺內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較CLP組明顯減輕（圖1）。

圖1 光鏡下5組小鼠肺組織HE染色（×400）

2.3 血清中TNF-α、HMGB1濃度測(cè)定結(jié)果

比較各組小鼠血清中的TNF-α水平：除FAS組的24 h時(shí)間點(diǎn)外，各組的濃度明顯高于NS組（P＜0.05），法舒地爾預(yù)處理能顯著降低6 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)膿毒癥小鼠血清中的TNF-α水平（P＜0.05），而在24 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。比較各組小鼠血清中的HMGB1水平：各組的濃度均高于NS組（P＜0.05），法舒地爾預(yù)處理能顯著降低24 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)膿毒癥小鼠血清中的HMGB1水平（P＜0.05），而在6 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組小鼠血清TNF-α、HMGB-1的表達(dá)（pg/m I±s，n=5）

表1 各組小鼠血清TNF-α、HMGB-1的表達(dá)（pg/m I±s，n=5）

與同時(shí)間點(diǎn)NS組比較，*P＜0.05；與CLP組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05；與同組6 h比較，▲P＜0.05

組別 TNF-α HMGB1 NS組6 h 24 h CLP組6 h 24 h FAS組6 h 24 h 29.47±2.52 30.24±1.20 22.97±3.80 30.66±4.78 48.66±5.16*34.81±4.58*▲38.96±7.63*77.32±15.07*▲38.11±6.71*#30.03±3.90▲29.18±5.66*62.06±11.59*#▲

2.4 小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度測(cè)定及肺組織HMGB-1mRNA的表達(dá)結(jié)果

比較各組小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度：除FAS組的6 h時(shí)間點(diǎn)外，各組的肺泡灌洗液總蛋白濃度明顯高于同時(shí)間點(diǎn)的NS組（P＜0.05），法舒地爾預(yù)處理能顯著降低各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的肺泡灌洗液中的總蛋白濃度（P＜0.05）（表2）。比較各組小鼠肺組織HMGB1 mRNA的表達(dá)：除FAS組的6 h時(shí)間點(diǎn)外，各組小鼠肺組織HMGB1 mRNA的表達(dá)明顯高于同時(shí)間點(diǎn)的NS組（P＜0.05），法舒地爾能顯著降低24 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)膿毒癥小鼠肺組織HMGB1 mRNA的表達(dá)（P＜0.05），而在6 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)，這種降低作用不顯著（P= 0.07）（表2、圖2）。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度（m g/m I）及肺組織HMGB1 m RNA的光密度比值測(cè)定（x±s，n=3）

圖2 5組小鼠肺組織HMGB1的表達(dá)情況

3 討論

在CLP術(shù)后，腸道作為膿毒癥的始動(dòng)器官，在腸道內(nèi)細(xì)菌毒素的刺激下通透性增加，細(xì)菌本身及其分泌產(chǎn)物大量經(jīng)腸道吸收入血進(jìn)入血液循環(huán)并分布于機(jī)體各主要器官及組織。肺臟由于其雙重血供、血管網(wǎng)密集和大量的肺泡間隙等特殊的解剖組織學(xué)特征致使血液內(nèi)的毒素和炎性細(xì)胞大量通過(guò)，并容留其中，這些炎性細(xì)胞大量釋放各種蛋白酶和炎癥因子，進(jìn)一步加重肺損傷［11］。

CLP模型肺損傷的嚴(yán)重程度與毛細(xì)血管滲漏和肺水腫的顯著性相關(guān)［12］。在本實(shí)驗(yàn)中，可通過(guò)肺泡灌洗液中蛋白質(zhì)的濃度及其光鏡下的病理改變加以證明，CLP組的小鼠的肺泡灌洗液濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高。同樣，在病理切片的觀察中，也可以發(fā)現(xiàn)CLP組小鼠肺中的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，血管充血和出血也隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高。Rho和Rho激酶參與中性粒細(xì)胞的激活，從而增加內(nèi)皮通透性和細(xì)胞因子介導(dǎo)的屏障功能障礙加重，因此法舒地爾作為特異性的Rho激酶抑制劑可預(yù)防中性粒細(xì)胞依賴性的氧化-炎癥通路的激活，從而有助于減少液體外滲和組織病理學(xué)的改善［13-14］。研究亦表明，法舒地爾無(wú)論在炎癥早期（6 h時(shí)間點(diǎn)）還是炎癥中晚期（24 h時(shí)間點(diǎn)）均可顯著降低肺泡灌洗液中的蛋白濃度，并使病理切片中的炎癥表現(xiàn)得到較大緩解。

既往認(rèn)為，早期促炎介質(zhì)（TNF-α、IL-1等）是膿毒癥引起肺損傷時(shí)機(jī)體失控性炎性反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，然而在臨床中采用TNF-α拮抗劑治療并未取得滿意效果，究其原因，可能是這些早期炎癥因子只在炎癥早期一過(guò)性升高，而此時(shí)患者可能并未入院治療，而其拮抗劑發(fā)揮作用時(shí)，這些因子早已恢復(fù)正常水平［15］。近年來(lái)一種“晚期”炎癥介質(zhì)——HMGB1逐漸進(jìn)入人們的視野，其通常在炎癥發(fā)生的6 h后才開(kāi)始升高，24 h達(dá)到高峰，并長(zhǎng)期處于高表達(dá)的狀態(tài)，因此成為多種疾病治療的新靶點(diǎn)。與TNF-α相似，在體外實(shí)驗(yàn)中，HMGB1處理過(guò)的細(xì)胞出現(xiàn)肺臟內(nèi)細(xì)胞局部炎癥時(shí)的表現(xiàn)，其可通過(guò)使血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重構(gòu)而使細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞間隙增加［16］。在本實(shí)驗(yàn)中，采用ELISA檢測(cè)各組小鼠血液中早期炎癥因子TNF-α和中晚期炎癥因子HMGB1，結(jié)果顯示，在CLP模型中TNF-α僅在炎癥早期一過(guò)性增高，至24 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)其表達(dá)明顯下降，而HMGB1在炎癥早期（6 h時(shí)間點(diǎn)）開(kāi)始增加，并在24 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)仍持續(xù)增加。同時(shí)，采用PCR的方法檢測(cè)各組小鼠肺組織中的HMGB1 mRNA的含量，結(jié)果顯示，CLP模型組的HMGB1mRNA表達(dá)量也隨炎癥時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)增高。有實(shí)驗(yàn)表明，Rho激酶參與多種誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的活化，如NF-κB和AP-1等［17-19］，而這些轉(zhuǎn)錄因子的出現(xiàn)對(duì)于轉(zhuǎn)錄一些炎癥基因（TNF-α，HMGB1等）起關(guān)鍵作用［20］，因此本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)AS各時(shí)間組小鼠血液中TNF-α、HMGB1等炎癥因子的表達(dá)均低于同時(shí)間組的CLP模型組。同理，F(xiàn)AS組小鼠肺組織中的HMGB1 mRNA的含量也低于同時(shí)間組的CLP模型組，尤以24 h組明顯。

總之，在采用CLP手術(shù)致小鼠腹部膿毒癥的模型中，可以發(fā)現(xiàn)法舒地爾作為一種特異性的Rho激酶抑制劑使用預(yù)處理的方式能減輕膿毒癥所致的不同時(shí)間點(diǎn)的急性肺損傷，減少肺組織的病理改變，其發(fā)揮的抗炎作用可能不僅局限于炎癥的早期階段，也可能通過(guò)下調(diào)HMGB1的表達(dá)等方式在炎癥的中晚期發(fā)揮作用。

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The influence of fasudil on acute lung injury induced by sePsis and the HMGB1 exPression in lung tissue

ZHAO Zhen1WEIGuang-yue2▲
1.Graduate School，Guilin Medical College，Guilin 541004，China；2.Department of Emergency，Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541004，China

Objective To observe the influence of fasudil on acute lung injury induced by sepsis inmice and the influence of using fasudil or not on the expression quality of HMGB1.Methods 48 BALB-Cmice were randomly divided into the control group，the cecal ligation and puncture（CLP）group，the fasudil preconditioning group.Blood，bronchoalveolar lavage fluid and lung ofmice was taken respectively at 6 and 24 hours time point for the analysis of results.Results At 6 and 24 hours time point，the increased TNF-αand HMGB1 level in serum and protein concentration in bronchoalveolar lavage fluid induced by CLP could be significantly reduced.In addition，pathological changes of lung tissue in mice was reversed by the fasudil preconditioning.At the same time，increased the expression quality of HMGB1 mRNA induced by CLP lung tissue in mice were reduced by fasudil.Conclusion Fasudil can alleviate the lung injury induced by CLP inmice and reduce the expression of HMGB1 of lung tissue.

Fasudil；Spesis；Acute lung injury；Rho kinase；HMGB1

R332

A

1674-4721（2015）02（c）-0004-04

2014-10-09本文編輯：許俊琴）

趙振（1989-），男，2012級(jí)在讀碩士研究生，急診醫(yī)學(xué)專業(yè)（重癥方面）

▲通訊作者：韋廣粵（1964-），男，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：呼吸機(jī)的臨床應(yīng)用