冀黎駿，唐 赟，譚 佳

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009)

隨著全球工業(yè)化步伐的加快，其對石油的需求量正已幾何速度不斷增長，隨之帶來的石油污染也就無法避免，每年全世界都有大量的石油污染物以各種形式進(jìn)入環(huán)境，污染水體、土壤和大氣［1］． 目前，世界各國都在致力于研制和開發(fā)石油污染修復(fù)技術(shù)，包括物理方法、化學(xué)方法、生物方法等． 其中物理方法為吸附的方式，但收效甚微;化學(xué)方法主要為研發(fā)消油劑，但其使用又會造成二次污染;生物方法則是通過微生物生長代謝使石油污染物降解，將其徹底礦化．由于生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、效率高、無二次污染、原位降解污染物等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為全世界的科研熱點(diǎn)［2］．

石油的組分非常復(fù)雜，包括數(shù)百種化合物，如飽和烴、芳香烴、瀝青質(zhì)等，但作為石油最重要的成分之一，烷烴的生物降解向來都是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)［3］．至今，已報道的烷烴降解菌主要有Acinetobacter［4］、Rhodococcus［5］、Alcanivorax［6］、Bacillus［7］等，但這只是冰山一角，自然界中依然蘊(yùn)藏著無數(shù)的微生物資源，從中分離篩選高效的解烴菌仍是環(huán)境資源微生物學(xué)的研究重點(diǎn)之一．

液體石蠟通常稱為產(chǎn)液蠟，是一種無色無味的粘稠液體，其主要成分為C16-C20的正構(gòu)烷烴，由原油中250 -400℃的輕質(zhì)潤滑油餾分得到．筆者從南充煉油廠土壤中馴化篩選出一株液體石蠟降解菌TY22，并根據(jù)常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定、生理生化測驗和16S rRNA 測序分析鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)．通過對其降解能力和生長特性的初步研究，以為該菌株對烷烴的生物修復(fù)應(yīng)用提供理論依據(jù)．

1 實驗材料與方法

1．1 樣品來源

南充煉油廠位于南充市主城區(qū)北半部的中心位置，處于城區(qū)上風(fēng)向．樣品為被石油污染的土壤，去除表層浮土后取樣．

1．2 主要試劑

天津化學(xué)試劑研究所生產(chǎn)的C6-C32正構(gòu)烷烴，其純度均大于98%;Sigma 公司Tryptone、Yeast Extract、Agar、NaCl、KCl、MgCl2、KH2PO4、K2HPO4．3H2O、MgSO4．7H2O、NaNH4HPO4．4H2O、無水乙醇等;天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、天根通用型DNA 純化回收試劑盒、天根質(zhì)粒小提試劑盒;Promaga 公司PCR 擴(kuò)增試劑盒(PCR CoreSystem II);TaKaRa 公司PMD19 -T 載體;青島海博生物技術(shù)有限公司生化鑒定管;杭州天和微生物試劑有限公司藥敏試劑盒．

1．3 培養(yǎng)基

1．3．1 E2 無機(jī)鹽培養(yǎng)基

KH2PO43．6 g，K2HPO4．3H2O 7．5 g，NaNH4HPO4．4H2O 3．5 g 定容至1L，pH 調(diào)至7．0，121 ℃高壓滅菌20min．固體培養(yǎng)基再加入1．5%的Agar．滅菌后加入1mL 1 mol/L MgSO4和1mL 微量元素溶液［8］．

1．3．2 LB 培養(yǎng)基Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，定容至1L，pH 調(diào)至7．0，121℃高壓滅菌20min．固體培養(yǎng)基再加入1．5%的Agar［9］．

1．3．3 液體石蠟培養(yǎng)基

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入1%(W/V)液體石蠟;固體培養(yǎng)基再加入1．5%的Agar．

1．4 高效解烴菌的富集、馴化、分離和純化

取適量土樣加入無菌水中，將土樣充分打碎搖勻后靜置30min，吸取上清液加入裝有液體石蠟培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃、180rpm 搖床培養(yǎng)3d;待培養(yǎng)液渾濁后，吸取培養(yǎng)液100μL 轉(zhuǎn)入900μL 無菌水中稀釋為10-1倍，再取10-1倍稀釋液100μL 轉(zhuǎn)入900μL 無菌水中稀釋為10-2倍，以此類推將培養(yǎng)液分別稀釋為10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍，吸取200μL 以上培養(yǎng)液分別涂布于液體石蠟固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)4d;最后挑取長勢最好單菌落以平板三區(qū)劃線法劃線于LB 固體培養(yǎng)基上，連續(xù)轉(zhuǎn)接多次后，得到純化單菌株．挑取單菌株分別接種于液體石蠟固體培養(yǎng)基和液體石蠟液體培養(yǎng)基中，在兩種培養(yǎng)基中均能生長的即為液體石蠟降解微生物．分別選取分離的菌株接種到液體石蠟培養(yǎng)基中，測試各菌種在30℃、180 rpm 培養(yǎng)72 h 時對液體石蠟的利用情況，篩選出高效的烷烴降解菌株．

1．5 高效解烴菌株的鑒定

1．5．1 形態(tài)、生理生化鑒定

將篩選出的菌株接種到LB 培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)12h，觀察菌落特征;采用革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、抗酸染色等方法對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，方法參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［10］． 生理化鑒定采用青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的生化鑒定管．藥敏實驗采用杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的藥敏試劑盒檢測．

1．5．2 菌株16S rRNA 序列測定

采用天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取TY22 菌株基因組DNA 作為模板，按如下體系對菌株16S rRNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［11］．

上游引物fD1:5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`

下游引物rD1:5`-AAGCAGGTGATCCAGCC-3`

100μLPCR 反應(yīng)體系:

100 倍稀釋DNA 模板4μL;

10μmol/L 上游引物fD1 10μL;

10μmol/L 下游引物rD1 10μL;

2 ×MasterMix 50μL;

ddH2O 加至總體積為100μL．

PCR 反應(yīng)條件:

94℃預(yù)變性5 min;

94℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72℃延伸1min，30 個循環(huán);

72℃最后延伸10 min;

4℃保溫．

擴(kuò)增所得DNA 片段與TaKaRa 公司生產(chǎn)的PMD19-T 載體16℃連接過夜，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α．將所得菌液涂布于藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR 鑒定［12］．將陽性轉(zhuǎn)化子送至北京泰和生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA 測序．將測序結(jié)果提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫，與相關(guān)序列進(jìn)行比對分析，利用MEGA5．0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用Kimura2-Parameter Distence 模型計算進(jìn)化距離，鄰位相連法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

1．6 菌株烷烴降解特性的研究

1．6．1 TY22 菌株在LB 液體培養(yǎng)基中生長曲線的測定

接菌于LB 液體培養(yǎng)基中，30℃、180rpm 搖床培養(yǎng)10h，然后取6mL 活化菌液轉(zhuǎn)入600mL 培養(yǎng)基中搖勻，再以每支10mL 的量分裝到60 個試管中，于30℃、180rpm 恒溫振蕩培養(yǎng)，通過連續(xù)測定各個時間點(diǎn)的菌液OD600值來反映LB 液體培養(yǎng)基中微生物的生長狀況． 每次隨機(jī)取3 支試管測定，取平均值繪制高效解烴菌TY22 的生長曲線，見圖2．

1．6．2 TY22 菌株在液體石蠟中的生長情況

取種子液0．5mL 接入50mL 以液體石蠟為唯一碳源和能源的液體石蠟液體培養(yǎng)基中于30℃、180rpm 振蕩培養(yǎng)．觀察觀察菌體生長情況，測定培養(yǎng)液OD600，見圖3．

1．6．3 純烴底物降解實驗

對菌株TY22 的烷烴利用范圍進(jìn)行了測定． 取種子液0．5mL 接入裝有50mL 液體培養(yǎng)基，于30℃、180rpm 振蕩培養(yǎng)40h．每種底物做3 個重復(fù)，觀察菌體生長情況，測定培養(yǎng)液OD600，見圖4．本實驗所用烷烴的滅菌方法參見文獻(xiàn)［13］．

2 結(jié)果與討論

2．1 高效解烴菌的分離

通過富集培養(yǎng)、馴化、分離和純化，篩選出兩株烷烴降解菌，分別取代號為TY21、TY22．選取對液體石蠟降解率更大的TY22 菌株用于進(jìn)一步實驗．

2．2 菌株鑒定

2．2．1 形態(tài)及生理生化特征結(jié)果

TY22 菌株革蘭氏染色呈陽性，油鏡觀察細(xì)胞呈長桿狀，產(chǎn)芽孢，芽孢呈橢圓形，周生鞭毛．在LB 固體培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)12 h 觀察菌落特征．單菌落呈類似圓形，有隆起，邊緣不規(guī)則，顏色為污白色，不透明．液體培養(yǎng)靜止時有菌膜形成．菌株生理生化測試結(jié)果見表1，結(jié)合菌株的形態(tài)特征和染色結(jié)果，參照參考文獻(xiàn)［10］，將其歸屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)．

抗生素實驗結(jié)果表明，TY22 菌株對克林霉素、鏈霉素、青霉素G、卡拉霉素、慶大霉素、氯霉素、新霉素、乙酰螺旋霉素、大觀霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、復(fù)方新諾明較敏感，對氨芐西林不敏感．

表1 TY22 菌株的生理生化測試結(jié)果Tab．1 Characteristics of strain TY22

續(xù)表1

2．2．2 16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對TY22 菌株16S rRNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，150V 電壓，待溴酚藍(lán)帶遷移至凝膠邊緣1 -3cm 時終止電泳，檢測其大小約為1．5kb． 測序后，得到1 435 bp 大小的TY22 菌株16S rRNA 核苷酸序列．將序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫，利用BLAST 軟件進(jìn)行相似性檢索比對分析．通過MEGA5．0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定分類地位，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1 所示．

圖1 TY22 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain TY22

結(jié)果顯示TY22 菌株與Bacillus subtilis(GQ199598)和Bacillus subtilis(EU257435)的進(jìn)化距離最小，相似性分別為99．9%和99．8% ．根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，最終將菌株TY22 鑒定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)．

2．3 高效解烴菌降解特性的研究結(jié)果

2．3．1 測定種子液生長曲線

測定TY22 菌株在LB 液體培養(yǎng)基中的生長曲線，以確定種子液的最佳接種時間．取6mL 活化菌液轉(zhuǎn)入600mL 液體培養(yǎng)基中搖勻，再以每支10mL 的量分裝到60 個試管中，于30℃、180rpm 恒溫震蕩培養(yǎng)，連續(xù)測定各個時間點(diǎn)的菌液OD600值，每次隨機(jī)取3 支試管測定，取平均值繪制生長曲線，見圖2．

圖2 種子液生長曲線Fig.2 Growth curve of seed culture

由圖2 知，TY22 菌株在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1．5h 后，進(jìn)入對數(shù)生長期;培養(yǎng)8h 后開始進(jìn)入生長穩(wěn)定期．確定菌株處于對數(shù)生長后期的培養(yǎng)時間，選擇培養(yǎng)7h 菌液作為種子液，此時菌體濃度可以達(dá)到108cells/mL．

2．3．2 TY22 菌株在液體石蠟中的生長情況

取0．5mL 種子液接入50mL 液體石蠟培養(yǎng)基中，于30℃、180rpm 恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔4 h 隨機(jī)取樣測定菌液OD600值，從而確定TY22 的生長情況，結(jié)果見圖3．如圖3 所示，TY22 在液體石蠟培養(yǎng)基中生長良好，延遲期約為2h，隨后進(jìn)入生長對數(shù)期，到40h 時進(jìn)入生長平穩(wěn)期，此時OD600為0．945．

圖3 液體石蠟培養(yǎng)基中TY22 菌株生長降解曲線Fig.3 Growth and degrading curve of strain TY22 in the liquid paraffin medium

2．3．3 烷烴降解范圍結(jié)果

烷烴降解范圍實驗結(jié)果如圖4 所示．TY22 菌株能夠快速的利用C6-C32鏈長的直鏈烷烴作為唯一碳源和能源生長，培養(yǎng)液呈混濁狀態(tài)．其中以C22最為明顯，經(jīng)過40h 培養(yǎng)的菌液OD600值可達(dá)到1．982．TY22 菌株對大于C16鏈長的烷烴也表現(xiàn)出了明顯的降解特性．即使在溶解度非常小的C32中，通過OD600的測定，表明也能夠很好的生長．

圖4 TY22 在C6-C32 培養(yǎng)基中菌體濃度Fig．4 The cell concentration of strain TY22 in the n-alkanes with chain length C6-C32

3 結(jié) 論

(1)通過馴化、篩選、分離和純化得到一株對液體石蠟有較強(qiáng)降解能力的菌株TY22，根據(jù)常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定、生理生化測驗和16S rRNA 測序分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)．(2)對液體石蠟的降解實驗表明，1%TY22 菌株種子液接入50mL 以液體石蠟為唯一碳源和能源的液體石蠟液體培養(yǎng)基中，30℃、180rpm 振蕩培養(yǎng)40h，生物量OD600可達(dá)0．945．說明該菌能夠很好的利用液態(tài)石蠟作為碳源和能源生長．(3)對于TY22 菌株降解烷烴的底物范圍進(jìn)行了測定:菌株對C6-C32的正構(gòu)烷烴均有較好的降解作用，尤其是對C22具有特別的降解能力．

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