陳靜等

摘 要 采用對峙培養(yǎng)法從來自土壤的136株細(xì)菌中篩選得到對火龍果潰瘍病菌有拮抗作用的菌株HTN-5，抑菌帶寬9.0 mm。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16s rDNA序列分析，將拮抗菌HTN-5初步鑒定為皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae。從8種培養(yǎng)基中篩選出IFFI培養(yǎng)基最有利于菌株HTN-5形成抑菌活性物質(zhì)，正交試驗(yàn)優(yōu)化其成分，得最優(yōu)配方為：牛肉膏2.50 g/L，蛋白胨10.00 g/L，葡萄糖12.50 g/L，乳糖10.00 g/L，酵母膏2.50 g/L，氯化鈉5.00g/L，pH 6.8。

關(guān)鍵詞 火龍果潰瘍病 ；皮氏類芽孢桿菌 ；拮抗菌 ；培養(yǎng)基優(yōu)化

分類號(hào) S667.9 ；S436.68

火龍果（Hylocereus spp.）是一種熱帶、亞熱帶水果，屬于仙人掌科Cactaceae量天尺屬Hylocereus植物?；瘕埞a(chǎn)中美洲，20世紀(jì)90年代引入我國，在廣東、廣西、海南、福建、云南和貴州等地廣泛種植，種植面積約1.3萬hm2。

近年來，火龍果遭受多種病害的侵襲[1]，其中，潰瘍病是危害最為嚴(yán)重的病害，在廣東、廣西等地導(dǎo)致許多果園丟荒，嚴(yán)重威脅火龍果的大面積種植和生產(chǎn)?；瘕埞麧儾∈怯尚掳瞪?jié)孢Neoscytalidium dimidiatum引起，主要危害莖，在高溫高濕下出現(xiàn)莖桿腐爛和果實(shí)開裂[2-3]，也可引起果肉褐腐或黑腐[4-5]。室內(nèi)毒力測定顯示，許多化學(xué)藥劑對火龍果潰瘍病菌有很好的抑制作用[6]，但在生產(chǎn)上還沒有行之有效的方法控制火龍果潰瘍病發(fā)生和蔓延。

筆者研究了一株從發(fā)病果園及其周圍土壤中分離篩選到對火龍果潰瘍病菌具有拮抗作用的細(xì)菌，對其進(jìn)行鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，以期為開發(fā)防治火龍果潰瘍病的生防制劑提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 火龍果潰瘍病菌

采用病組織分離法[7]，從具有火龍果潰瘍病典型癥狀的組織上分離得到，經(jīng)致病性測定，確定為病原菌，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為新暗色柱節(jié)孢N. dimidiatum[3]，菌種保存在廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 拮抗菌的分離篩選

分離：采用稀釋平板法從樣品分離細(xì)菌。將從廣東湛江地區(qū)發(fā)病果園及其周圍土壤中采集樣品，稀釋105倍，沸水浴5 min后，取200 μL稀釋液涂布于冷卻的PDA培養(yǎng)皿上，28℃培養(yǎng)48～64 h。

篩選：采用平板對峙法進(jìn)行篩選。將火龍果潰瘍病菌接種到PDA平板上28℃培養(yǎng)3 d，用打孔器取直徑6.0 mm 的菌餅接種到PDA培養(yǎng)皿中央。用接種環(huán)挑取細(xì)菌接種到距菌餅3 cm處，每個(gè)菌餅周圍接種4 個(gè)細(xì)菌單菌落，28℃黑暗培養(yǎng)，3 d后觀察抑菌帶的形成，記錄抑菌帶的寬度和細(xì)菌菌落直徑，計(jì)算抑菌帶的寬度與細(xì)菌菌落直徑的比值，比值越大，抑菌效果越好。將對火龍果潰瘍病菌有拮抗作用的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到PDA平板，劃線分離純化，在4℃冰箱中保存。

復(fù)篩：將有抑菌活性的細(xì)菌再次進(jìn)行平板對峙試驗(yàn)，測定其抑菌作用，挑取抑菌效果最好的菌株進(jìn)行鑒定及產(chǎn)抗菌物質(zhì)培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1.3 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)培養(yǎng)基篩選

供試培養(yǎng)基有（1）BPDB：馬鈴薯200 g、牛肉膏20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（2）改良BPDB：馬鈴薯200 g、牛肉膏20 g、蛋白胨7 g、葡萄糖20 g、玉米粉7 g、水1 000 mL、pH自然；（3）YPAD：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（4）NYDA：牛肉膏8 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（5）BPY：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2；（6）玉米粉培養(yǎng)基：玉米粉5 g、蛋白胨0.1 g、葡萄糖1 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（7）IFFI：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、乳糖尿5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.8；（8）NA：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然。

將經(jīng)活化后的拮抗菌用無菌水配成106～107 CFU/mL的菌懸液，按1%的接種量接種到裝有20 mL BPDB 培養(yǎng)液的50 mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為150 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中28℃下黑暗培養(yǎng)24 h，作為種子液。按1%的接種量將種子液分別接種到裝有供篩選培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，裝瓶量為20 mL，150 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 后，經(jīng)12 000 r/min，離心15 min，取上清液，用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾除菌，經(jīng)無菌檢驗(yàn)后得到無菌發(fā)酵液。

牛津杯法測定無菌發(fā)酵液的抑菌活性?；瘕埞麧儾【赑DA平板上培養(yǎng)7 d后，用無菌水將孢子洗后加入PDA培養(yǎng)基中，制備含菌量為104～105個(gè)孢子/mL的帶菌PDA平板。在每個(gè)平板中放4個(gè)牛津杯，加200 μL無菌發(fā)酵液至牛津杯，28℃培養(yǎng)72 h后，測量抑菌圈大小，篩選得到最有利于產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行成分優(yōu)化。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)培養(yǎng)基優(yōu)化

從8種供試發(fā)酵培養(yǎng)基中篩選出最有利于拮抗菌產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基IFFI，采用L16（45）正交試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)基成分優(yōu)化（表1）。培養(yǎng)基接種、發(fā)酵條件和發(fā)酵液抑菌活性測定同1.3，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)配方。

1.5 拮抗菌的鑒定

形態(tài)學(xué)和生理生化特性：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[9]。

16s rDNA序列分析：16s rDNA序列擴(kuò)增引物為細(xì)菌鑒定通用引物（27f：5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3和1512R：5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3）[10]。將保存的拮抗菌劃線接種PDA平板，用無菌牙簽挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR[11]。PCR反應(yīng)體系采用TaKaRa公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2試劑盒，反應(yīng)體積50 μL。PCR擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性1 min，56 ℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將所得序列在GenBank進(jìn)行BLAST分析，選取與病菌序列同源性高及近緣種菌株序列，用MEGA 6.0[12]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離及篩選

從廣東省湛江地區(qū)發(fā)病果園及其周圍土壤中采集的樣品中分離得到136株細(xì)菌，平板對峙試驗(yàn)結(jié)果顯示，其中12株對火龍果潰瘍病菌有抑制作用，通過復(fù)篩，7菌株仍有很好的抑制作用（表2）。

從表2可以看出，細(xì)菌HTN-5抑菌效果最好，在初篩和復(fù)篩時(shí)，均形成抑菌帶寬9.00 mm，抑菌活性穩(wěn)定。復(fù)篩時(shí)，抑菌帶寬與菌落直徑比值最大為1.64。

2.2 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)培養(yǎng)基篩選

將HTN-5接種到8種供試發(fā)酵培養(yǎng)基中，無菌發(fā)酵液的拮抗活性順序?yàn)椋篒FFI>NYDA>YPAD>改良BPDB> BPDB>玉米粉培養(yǎng)基>BPY>NA。對應(yīng)的抑菌圈直徑分別為21.00、20.50、18.50、17.50、15.50、13.00、11.50和9.50 mm。用IFFI發(fā)酵的發(fā)酵液拮抗效果最好，故以IFFI作為最適發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行含量優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)培養(yǎng)基成分優(yōu)化

對拮抗效果最好的發(fā)酵培養(yǎng)基IFFI進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，改變蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乳糖5個(gè)因素的用量，用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基成分，試驗(yàn)結(jié)果見直觀分析表（表3）。

從表3可以看出，各因素的極差排序?yàn)榕Ｈ飧?gt;蛋白胨>葡萄糖>乳糖>酵母膏，表明牛肉膏為影響拮抗菌HTN-5產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的最主要因素，發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為牛肉膏2.50 g/L，蛋白胨10.00 g/L，葡萄糖12.50 g/L，乳糖10.00 g/L，酵母膏2.50 g/L，氯化鈉5.00 g/L，pH 6.8。經(jīng)檢驗(yàn)，無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑為23.30 mm，抑菌活性提高了11.0%，更有利于生產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)。

2.4 拮抗細(xì)菌的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

形態(tài)學(xué)特征：在PDA培養(yǎng)基，菌株HTN-5菌落圓形突起，乳白色，有光澤，不透明，具有粘性，邊緣整齊，培養(yǎng)72 h可活躍擴(kuò)展為“運(yùn)動(dòng)的菌落”（圖1A）。菌體細(xì)胞桿狀，成對排列，G+（圖1B），0.33 μm×1.87 μm （n>50）；可形成內(nèi)生芽孢，芽孢囊膨脹，芽孢橢圓形。

生理生化特征（表4）：該菌產(chǎn)生過氧化氫酶，可分解葡萄糖和甘露醇，能夠液化明膠和水解淀粉；在pH 5.7和6.8的營養(yǎng)肉湯中能生長；在含2%、5%和7% NaCl的培養(yǎng)基中生長；在20、30、37和41℃下可生長。V.P.反應(yīng)、肌醇降解、利用葡萄糖產(chǎn)氣、苯丙氨酸脫氨酶和卵磷脂酶測定、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)，硝酸鹽還原反應(yīng)均為陰性；在含10% NaCl的培養(yǎng)基中不生長；在4、45和65℃下不可生長。

16s rDNA序列分析：菌株HTN-5的16s rDNA序列經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1 039 bp的片段（KT274704），在GenBank中進(jìn)行Blast比對，菌株HTN-5的16s rDNA序列與皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae 模式菌株DSM 8320（HG794409），多粘類芽孢桿菌P. polymyxa 模式菌株DSM 36（HG324071）和P. brasilensis模式菌株ATCC BAA-413（AF273740）的序列同源性均為99%。從GenBank中選取類芽孢桿菌屬Paenibacillus的近緣種序列，Mega 6.0 軟件進(jìn)行Clustal比對后，采用最大似然數(shù)法（Maximum Likelihood method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）， HTN-5與P. peoriae DSM 8320聚集在同一個(gè)分枝上，而與P. polymyxa DSM 36和P. brasilensis ATCC BAA-413位于不同分枝上。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及系統(tǒng)發(fā)育分析，將拮抗菌HTN-5初步鑒定為皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae[13-16]。

3 討論與結(jié)論

火龍果潰瘍病是一個(gè)世界性的病害，在馬來西亞、以色列、墨西哥、美國和尼加拉瓜等火龍果種植區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重危害火龍果的產(chǎn)量和質(zhì)量。火龍果潰瘍病菌在自然界中通過無性孢子蔓延和傳播，在高溫高濕條件下容易爆發(fā)。雖然毒力測定結(jié)果顯示有一些化學(xué)藥劑對其有很好的抑制作用，有希望控制該病的發(fā)生和蔓延，但是在田間并沒有表現(xiàn)出很好的防治效果，因此，應(yīng)用拮抗菌防治火龍果潰瘍病是一條很好的途徑。

皮氏類芽孢桿菌P. peoriae（早期為Bacillus peoriae）是一個(gè)土壤習(xí)居菌，最早于1993年從土壤根際中分離，Heyndrickx等對Bacillus peoriae和B. lautus進(jìn)行修訂時(shí)確定的一個(gè)新組合種[13]。皮氏類芽孢桿菌P. peoriae對多種植物病原菌有很好的拮抗作用，產(chǎn)生如細(xì)胞外蛋白水解酶和幾丁質(zhì)酶等抗菌物質(zhì)，并且能夠固氮[17-18]，是一個(gè)潛在的生物防治菌。本研究篩選到一株細(xì)菌菌株HTN-5，對火龍果潰瘍病原菌具有明顯的拮抗作用，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16s rDNA序列分析，將拮抗菌HTN-5初步鑒定皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae。目前，有關(guān)皮氏類芽孢桿菌P. peoriae作為生物防治菌的研究報(bào)道較少，因此有必要深入研究該菌的抑菌機(jī)制、在環(huán)境的定殖以及產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的主要成分等，以期更好開發(fā)利用皮氏類芽孢桿菌P. peoriae。

皮氏類芽孢桿菌P. peoriae菌株HTN-5對火龍果潰瘍病菌有穩(wěn)定的抑制作用，具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。本研究對其產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，為開發(fā)菌株HTN-5防治火龍果潰瘍病的生防藥劑奠定一定的基礎(chǔ)。

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