楊繼敏++朱科學

摘 要 對電熱鼓風干燥和真空冷凍干燥的胡椒梗主要組分進行分析，并采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（SPME-GC-MS）對兩種干燥方式下胡椒梗中的香氣成分進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胡椒梗中胡椒堿含量0.07～0.10 g/hg、脂肪含量約0.9%、粗蛋白含量17%～19%、總酚含量2.5%～2.8%、維生素C含量2.8～5.6 mg/hg。胡椒梗中鑒定出的主要化學成分為：芳樟醇、δ-欖香烯、古巴烯、石竹烯、律草烯、杜松烯含量較多，以石竹烯含量最高（≥52.55%）。

關(guān)鍵詞 胡椒梗 ；胡椒堿 ；香氣成分 ；GC-MS

分類號 TS207.3

胡椒（Piper nigrum L.）是胡椒科胡椒屬多年生常綠藤本植物，原產(chǎn)于印度，是世界上重要的熱帶香辛料作物，是人們非常喜愛的調(diào)味品，在醫(yī)學工業(yè)和食品工業(yè)都有廣泛用途[1]。胡椒果實主要化學成分包括：生物堿（主要是吡咯烷類酰胺生物堿）、揮發(fā)油、有機酸、木脂素、酚類化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉和微量元素等[2]。

胡椒粒中胡椒精油含量約1%～2%，主要成分是萜烯類物質(zhì)，包括單萜類化合物、單萜類氧化物和倍半萜類化合物，是胡椒的主要風味物質(zhì)，具有暖身、活血、刺激血液循環(huán)的功效；其中胡椒堿含量8%～9%，是胡椒的主要辛辣成分，具有抗氧化作用、抗菌等多種生理藥理活性；胡椒油樹脂包含胡椒總的辛辣刺激與芳香成分，具有比較廣泛的藥理作用，可作為加工保健及功能（效）食品的原料[3]。胡椒的經(jīng)濟價值非常高，胡椒果實中含有酰胺類殺蟲活性物質(zhì)等有效成分，可用來加工成黑胡椒、白胡椒等初產(chǎn)品；胡椒穗等部位中胡椒堿含量較高，能夠用于開發(fā)胡椒堿產(chǎn)品開發(fā)利用；同時，胡椒提取物有自由基清除能力以及抗食用油脂氧化作用，可用于治療胃寒嘔吐、食欲不振及預防膽囊結(jié)石等病癥；胡椒根乙醇提取物具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜以及抗驚厥效果；胡椒粒在穴位貼敷治療肩周炎方面具有良好的效果[4]。

目前對于胡椒果、胡椒葉的研究頗多，國內(nèi)外關(guān)于胡椒果實、莖、葉、根揮發(fā)油研究已有報道。而胡椒脫粒后的胡椒梗大多被廢棄，鮮有研究報道。因此，本研究以胡椒梗作為原料，經(jīng)過電熱鼓風干燥箱和真空冷凍干燥機兩種干燥方式后，對其胡椒堿含量及香氣成分進行檢測分析，研究結(jié)果可為胡椒全植株的利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

胡椒鮮果由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所提供，將胡椒粒去除后保留胡椒梗并進行清洗，然后分別放在電熱鼓風干燥箱中（45±2）℃干燥24 h和真空冷凍干燥按照研究室青胡椒真空冷凍干燥工藝進行[5]，粉碎后過80目篩，備用。

1.1.2 試劑

95%乙醇（分析純）：西隴化工股份有限公司；胡椒堿標準品：北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；石油醚（沸程30～60℃，分析純）：西隴化工股份有限公司；沒食子酸： 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸：廣東光華化學廠有限公司；碳酸鈉：廣東·汕頭市西隴化工廠；福林酚：上海荔達生物科技有限公司；磷酸二氫鉀（≥99.5%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 設(shè)備

AL104 電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；QE-300G高速萬能粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；FD-2真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；MB45快速水分測定儀（美國奧豪斯儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司）；Z36HK 離心機（德國Hermle）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）； SDXTEC2050脂肪測定系統(tǒng)（丹麥福斯FOSS公司）；NDA701杜馬斯定氮儀（意大利VELP公司）；7890A/5975C GC/MS 聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；SPME手動進樣手柄（美國安捷倫公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭（美國安捷倫公司）。

1.2 方法

1.2.1 胡椒堿含量的測定

將兩種不同干燥方式處理的胡椒梗樣品粉碎過篩，根據(jù)GB/T17528-2009《胡椒堿含量的測定 高效液相色譜法》規(guī)定的方法測定。即準確稱取0.2 g胡椒梗粉末樣品，精確至0.000 1，用95%乙醇回流提取3 h，提取液經(jīng)過濾并定容至100 mL棕色容量瓶中。取1 mL濾液稀釋至25 mL容量瓶中并用95%乙醇定容，所有過程均避光處理。平行3次。稀釋液過0.45 μm膜后用HPLC測定，外標法定量。

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：77%甲醇和23%水；流速：1.0 mL/min；色譜柱溫度：30℃；檢測波長：343 nm；進樣量：10 μL。

1.2.2 脂肪含量的測定

首先將鋁制稱量皿放入電熱鼓風干燥箱中，在（103±2）℃溫度下干燥至恒重（前后稱量差不超過0.002 g）。然后將過篩樣品，準確稱取2 g左右，精確至0.000 1，放入濾紙筒內(nèi)，往脂肪測定儀器中注入沸程（30～60）℃石油醚，儀器自動提取完畢后，取出鋁制稱量皿，置于（103±2）℃干燥箱內(nèi)干燥1 h，取出并放入干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱量后再放入干燥箱內(nèi)0.5 h，取出冷卻，稱量，重復操作直至前后2次稱量差不超過0.002 g。平行測定3次，取均值。

1.2.3 粗蛋白含量測定——杜馬斯燃燒法

測定步驟： 稱取50～100 mg樣品于錫箔紙中壓實，擠出空氣，并置于自動落樣器上，待上機檢測。

樣品燃燒反應(yīng)條件： 溫度為1 200 ℃，氧氣因子為1.8 mL/mg，氧氣流速為400 mL/min，氦氣、氧氣、氮氣壓力分別為2.0、2.5和3.0 Pa，高溫下充分燃燒分解，生成的氣體被凈化、除雜，以氦氣為載氣傳送，氮氧化物被還原后，混合氣體被吸附，分離，依次通過檢測器（TCD）檢測定量[6]。樣品粗蛋白含量計算公式： 粗蛋白含量=總氮含量/樣品質(zhì)量×換算系數(shù)6.25。每組做3次平行，取平均值。

1.2.4 總酚含量的測定

采用福林酚法[7]測總酚含量，取1 g胡椒梗粉末樣品，加入30 mL質(zhì)量分數(shù)60%乙醇在40 ℃下震蕩（100 r/min）提取4 h，5 000×g離心20 min。取0.1 mL上清液加入4.9 mL稀釋10倍的福林酚試劑和3 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的Na2CO3，40℃下反應(yīng)60 min后，在750 nm處測量吸光值。每組樣品做3個平行求平均值，根據(jù)以沒食子酸作的標準曲線計算總酚的質(zhì)量分數(shù)，樣品中總酚的質(zhì)量分數(shù)用沒食子酸當量（mg/g）表示。

1.2.5 Vc含量的測定

參照Tiwari[8]的方法，采用HPLC測定維生素C含量，并略作修改。樣品前處理：取約2 g胡椒梗粉末樣品，加入30 mL 2.5%偏磷酸溶液，4 ℃下靜置提取3 h，在12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，過濾得維生素C提取液，取上清液用0.45 μm的濾膜過濾。

HPLC測定：流動相A為乙腈，流動相B為25 mmol/L的磷酸二氫鉀溶液（磷酸調(diào)pH值為3.0）；檢測波長為254 nm；洗脫條件 95%的KH2PO4和5%乙腈等度洗脫；溫度30℃；進樣量10 μL；流速1 mL/min。

1.2.6 固相微萃取法（SPME）提取胡椒的香氣物質(zhì)[9]

將固相微萃取的萃取纖維頭在氣相色譜的進樣口老化，老化溫度為250℃，載氣體積流量為0.8 mL/min，分流比為50∶1，老化時間為0.5 h。稱取適量胡椒梗粉，置于15 mL 密封頂空樣品瓶中，用固相微萃取纖維頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS 于45℃頂空萃取30 min，然后在250℃條件下解吸8 min 進樣。

GC-MS分析[10]，色譜條件：色譜柱，DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為45℃，以10℃/min升至85℃；以5℃/min升至160℃并保持2 min；再以15℃/min升至220℃；載氣：氦氣；柱流量1.00 mL/min；分流比10∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量， 70 eV；離子源溫度230℃；接觸面溫度為250℃；ACQ方式：Scan；掃描范圍，40～400 amu；掃描速度：769/s。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel、Origin、SAS軟件及儀器自帶軟件處理，差異顯著性水平<0.05，平均數(shù)之間的比較采用極差檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種干燥方式下胡椒梗中胡椒堿及其他成分含量

胡椒堿液相色譜及標準曲線見圖1。

由圖1可知，胡椒堿的出峰時間基本在5.35 min處，而標準曲線R2=0.999 9。此標準曲線的相關(guān)性較好，可用于計算胡椒梗中胡椒堿的含量。

Vc分析見圖2。由圖2可知，Vc的出峰時間基本在5.4 min左右，所得標準曲線R2=0.999 5，此標準曲線的相關(guān)性較好，可用于計算胡椒梗中Vc的含量。

胡椒梗中胡椒堿及其他成分含量見表1。

胡椒堿是胡椒主要的活性物質(zhì)，也是胡椒的主要辛辣成分，由表1可知，胡椒梗中胡椒堿的含量很低，遠少于胡椒種子中胡椒堿（8%～9%）含量。胡椒梗中的脂肪含量非常低，遠少于胡椒種子中含有6%～8%的粗脂肪。杜馬斯燃燒法測粗蛋白，結(jié)果準確、重現(xiàn)性好，其前處理簡單，時間短，成本低，且避免造成環(huán)境污染，適用于油料實際樣品粗蛋白含量檢測[6]，結(jié)果顯示，胡椒梗中粗蛋白含量高于17%。福林酚試劑測量總酚法是研究天然產(chǎn)物抗氧化活性的常用方法，它方便、簡單并且重現(xiàn)性好等優(yōu)點[11]，本實驗福林酚法結(jié)果表明胡椒梗中的總酚含量約為2%～3%。維生素C是維持人體正常生理代謝的一種重要化合物，可參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，具有解毒的作用，人體自身不能合成，必須由食物中獲得，而從表1可以知，胡椒梗中的Vc含量為2.8～5.6 mg/hg。

此外，通過統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)冷凍和熱風干燥兩種方式胡椒梗中胡椒堿、脂肪的含量沒有差異，說明兩種干燥方式對胡椒堿、脂肪幾乎沒有影響。然而，兩種干燥方式下胡椒梗中粗蛋白、總酚、Vc含量具有顯著性差異，說明不同的干燥方式對于胡椒梗中的粗蛋白、總酚、Vc含量有一定影響。真空冷凍干燥對胡椒梗Vc含量基本沒有影響，而熱風干燥由于溫度較高使其分解流失，損失較嚴重。

2.2 兩種干燥方式下胡椒梗GC-MS結(jié)果分析

熱風干燥和冷凍干燥胡椒梗GC-MS圖譜見圖3、4。

采用固相微萃取法檢測胡椒梗中的香氣成分，采用背景扣除、自動積分和面積歸一化法計算各組分相對含量。對各峰質(zhì)譜圖進行NIST譜庫檢索和人工譜圖解析，通過GC-MS數(shù)據(jù)庫搜索和結(jié)合文獻、MS和部分保留指數(shù)，鑒定化學物質(zhì)如表2所示。

由表2可知，熱風干燥胡椒梗鑒定出25種化學成分，冷凍干燥胡椒梗中分離鑒定出29種化學成分，且面積百分比之和均在99%以上。其中共有成分中芳樟醇、δ-欖香烯、古巴烯、石竹烯、律草烯、杜松烯含量較多，以石竹烯含量最高。這些大量的共同成分使兩種干燥方式的胡椒梗具有相似的氣味，而且這些含量較多的物質(zhì)中有很多具有生物活性。如δ-欖香烯具有顯著的抗腫瘤作用；而β-欖香烯屬國家二類非細胞毒性腫瘤藥物，藥理研究表明，石竹烯具有局麻、抗炎等作用[11]。從兩種干燥方式胡椒梗中不同的化學成分發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥胡椒梗中的單萜類物質(zhì)較多，而倍半萜類物質(zhì)較電熱鼓風干燥胡椒梗中的含量稍低，可能是由于熱風干燥時溫度相對較高，對單萜類化學物質(zhì)產(chǎn)生的影響。

3 討論

目前，風味成分分析方法有很多種，如溶劑萃取、蒸餾萃取和固相微萃取等，其中最常用也最有效的胡椒有效成分的分析方法是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。國內(nèi)對黑、白胡椒以及胡椒精油的化學成分分析較多，如柳中等[12]分析了海南黑、白胡椒的香氣成分，得出主體香氣成分為α-蒎烯、3-蒈烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-檸檬烯和石竹烯等物質(zhì)；譚樂和等[13]對胡椒揮發(fā)油的研究表明，胡椒精油的主要成分為3-蒈烯、檸檬烯、反式-石竹烯、β-蒎烯、L-水芹烯、α-蒎烯等；郭墨亭等[14]通過超聲波處理提取胡椒幼果、黑胡椒和白胡椒的胡椒油樹脂，并采用GC-MS測定比較其香氣成分，最終從胡椒幼果油樹脂中分離出25種物質(zhì)，鑒定出20種；黑、白胡椒油樹脂中均分離出28種物質(zhì)，鑒定出23種；胡椒油樹脂香味成分主要是α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、D-檸檬油精、4-乙烯基-4-甲基-3-（1-甲基乙烯基）環(huán)己烯、石竹烯和胡椒堿等。以上研究的胡椒中香氣成分與本文所鑒定出的香氣物質(zhì)成分有所差異。然而，在國外Kapoor等[15]人得到黑胡椒精油的主要成分為石竹烯、檸檬烯、蒎烯和香薈烯；Singh等[16]鑒定出黑胡椒揮發(fā)油的主要成分為石竹烯、檸檬烯、香薈烯、β-紅沒藥烯和α-古巴烯；Jirovetz等[17]運用固相微萃取-氣相色譜分析和固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析，對比干燥胡椒芳香成分和喀麥隆的幾內(nèi)亞黑、白胡椒的香精油成分，發(fā)現(xiàn)含量較高的物質(zhì)為β-石竹烯、D-吉瑪烯、檸檬烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-蛇麻烯等；與本文鑒定出的主要香氣成分較接近。

通過研究發(fā)現(xiàn)，胡椒梗中胡椒堿含量為0.07～0.10 g/hg，脂肪含量約0.9%，粗蛋白含量17%～19%，總酚含量2.5%～2.8%，維生素C含量2.8～5.6 mg/hg。而從胡椒梗中鑒定出的主要成分為：芳樟醇、δ-欖香烯、古巴烯、石竹烯、律草烯、杜松烯含量較多，以石竹烯含量最高（≥52.55%）。

本論文對電熱鼓風干燥和真空冷凍干燥胡椒梗中的胡椒堿、脂肪、粗蛋白、總酚及Vc含量進行分析檢測，并運用固相微萃取法對兩種干燥方式的胡椒梗進行香氣成分及含量分析。此外，還分析了電熱鼓風干燥和真空冷凍干燥對胡椒梗以上各物質(zhì)含量的影響，為胡椒全果植株的利用提供了基礎(chǔ)。

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