劉佳宇，趙妍蕊，張麗娜，3，閆曄，鄭紅△

臨床研究

上皮源性卵巢癌中4種miRNAs的表達(dá)及其臨床意義

劉佳宇1，2，趙妍蕊1，張麗娜1，3，閆曄4，鄭紅1△

目的分析上皮源性卵巢癌（EOC）組織中miR-200a、miR-141、miR-205和miR-34a的表達(dá)及其臨床意義。方法44例EOC患者按FIGO分期分為FIGOⅠ～Ⅱ（FIGO早期組）組15例和FIGOⅢ～Ⅳ（FIGO晚期組）組29例，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量比較2組4種miRNAs的表達(dá)差異并考察4種miRNAs表達(dá)間的關(guān)聯(lián)。以各組miRNAs表達(dá)的中位數(shù)將EOC患者分為miRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較2組患者間的生存差異。按年齡、FIGO分期、術(shù)后是否有殘余瘤及術(shù)后化療情況分組，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析和Cox多因素分析。結(jié)果FIGO晚期組miR-141的表達(dá)高于早期組（P=0.036）。miR-141的表達(dá)與miR-200a、miR-205呈正相關(guān)，與miR-34a呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）；miR-200a與miR-205的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。生存分析顯示，miR-200a的表達(dá)低，卵巢癌患者無進(jìn)展生存期短（P=0.035），F(xiàn)IGO早期組生存率高于FIGO晚期組（P＜0.05）。miR-200a的表達(dá)水平、FIGO分期以及年齡與卵巢癌患者總生存期和無進(jìn)展生存期有關(guān)，miR-141、miR-205和miR-34a的表達(dá)水平、術(shù)后殘余瘤以及化療與患者生存無關(guān)。結(jié)論miR-200a的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后有關(guān)，可能是卵巢癌患者預(yù)后預(yù)測的獨(dú)立影響指標(biāo)。

微RNAs；卵巢腫瘤；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；上皮源性；miR-200a；miR-141；miR-205；miR-34a

上皮源性卵巢癌（EOC）發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于子宮癌，但其致死率位居?jì)D科腫瘤之首［1］。卵巢位于盆腔深部，不易捫及，缺乏典型的早期臨床癥狀和有效的診斷方法，發(fā)現(xiàn)EOC時(shí)已多處于腫瘤晚期并發(fā)生了腹腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EOC預(yù)后不良者較多，進(jìn)展期患者的5年生存率甚至不到30%［2］。2010年，EOC位于中國城市女性惡性腫瘤發(fā)病率第9位，致死率卻是婦科腫瘤第1位［3］。因此，EOC發(fā)生發(fā)展中進(jìn)行分子標(biāo)志物的研究對(duì)EOC的防治有重要意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮源性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要事件［4］，是一個(gè)有序的基因表達(dá)調(diào)控過程，多種轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子如microRNAs（miRNAs或miRs）參與其中［5］。筆者前期研究顯示，有9種miRNAs在EOC患者血漿中表達(dá)高于健康對(duì)照組，其中包含miR-205、miR-141、miR-200a、miR-34a 4種與EMT相關(guān)的miRNAs［6］。本研究旨在探討這4種miRNAs在EOC組織中的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2007年2月—2010年7月于天津市腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療的44例EOS組織樣本，患者平均年齡（57.48±11.77）歲。組織學(xué)類型：漿液性癌20（45.5%）例、子宮內(nèi)膜樣癌12（37.3%）例、黏液性5（11.4%）例、透明細(xì)胞癌3（6.8%）例及其他病理類型上皮源性癌4（9.0%）例。國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）的分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期5例、Ⅱ期10例、Ⅲ期25例、Ⅳ期4例。所有患者術(shù)前均未接受過放、化療，術(shù)后均經(jīng)病理明確診斷。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.2 主要儀器與試劑總RNA提取試劑Trizol、miRNAs特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNAs特異性TaqMan MGB探針引物及TaqMan PCR Master Mix（No UDG）均購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。4種miRNAs及其內(nèi)參照的名稱及檢測序列信息，見表1。

Tab.1 The sequence and assay ID of 4 miRNAs and RNU6B表1 4種miRNAs及其內(nèi)參照的序列及特異性引物探針產(chǎn)品編號(hào)

1.3 方法（1）提取組織總RNA。取凍存的EOC組織樣本50 mg在液氮中研磨至粉末狀，加1 mL Trizol并按說明書提取總RNA，NanoDrop 2000c（Thermo公司）微量紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，稀釋至50 mg/L，-80℃保存。（2）cDNA合成。依據(jù)試劑盒說明書，采用miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem-loop）特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，總反應(yīng)體系為15 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。cDNA樣本置于-20℃保存。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR。每個(gè)PCR反應(yīng)體系為15 μL，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔重復(fù)檢測，用ABI Prism7900HT熒光定量PCR儀進(jìn)行TaqMan熒光定量檢測。反應(yīng)條件：95℃變性10 min；95℃15 s，60℃60 s；40個(gè)循環(huán)。以RNU6B作為內(nèi)參照，以lg2-△△Ct表示miRNA的相對(duì)表達(dá)量，Ct值為循環(huán)閾值，以內(nèi)參照RNU6B循環(huán)閾值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，△Ct=（CtmiRNA-CtRNU6B），△△Ct=△Ct-△Ctmean。

1.4 觀察指標(biāo)將44例EOC患者按FIGO分期分為FIGOⅠ～Ⅱ（FIGO早期組）組15例和FIGOⅢ～Ⅳ（FIGO晚期組）組29例，比較2組4種miRNAs的表達(dá)差異。對(duì)44例EOC患者進(jìn)行定期隨訪，截止時(shí)間為2012年12月，其中2例失訪，隨訪率95.45%。隨訪時(shí)間5～49個(gè)月，中位時(shí)間26個(gè)月，20例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，15例在隨訪期發(fā)生腫瘤相關(guān)死亡。以各組miRNAs表達(dá)的中位數(shù)將EOC患者分為miRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較2組患者間的生存差異。臨床資料中按年齡、FIGO分期、術(shù)后是否有殘余瘤及術(shù)后化療情況進(jìn)行分組納入生存分析。無進(jìn)展生存期（PFS）定義為患者接受治療，到出現(xiàn)EOC局部區(qū)域的復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或死亡的時(shí)間?？偵嫫冢∣S）定義為從確診患EOC到死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad Prism 5.0和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2組間均值比較行t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的行秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，用log-rank法檢驗(yàn)生存率差異。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)影響PFS及OS的因素進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.14 種miRNAs在EOC組織中的表達(dá)情況及其與FIGO分期的關(guān)系FIGO晚期組miR-141的表達(dá)高于早期組（P＜0.05）；但2組miR-200a、miR-205和miR-34a表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Expressions of 4 miRNAs in EOC tissue and the relationship between them and FIGO stage表2 4種miRNAs在EOC組織中的表達(dá)情況及其與FIGO分期的關(guān)系

Tab.2 Expressions of 4 miRNAs in EOC tissue and the relationship between them and FIGO stage表2 4種miRNAs在EOC組織中的表達(dá)情況及其與FIGO分期的關(guān)系

＊P＜0.05

組別FIGO早期組FIGO晚期組t miR-34a 5.29±0.39 5.26±0.35 0.087 n 15 29 miR-141 6.06±1.17 6.70±0.59 2.092＊miR-200a 5.76±1.14 6.34±0.52 1.622 miR-205 4.92±1.32 5.60±0.84 1.869

2.2 EOC組織中4種miRNAs表達(dá)量之間的相關(guān)性miR-141與miR-200a和miR-205表達(dá)量呈正相關(guān)，與miR-34a呈負(fù)相關(guān)（r分別為0.962、0.590及-0.346，均P＜0.05）；miR-200a與miR-205表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.619，P＜0.05）；miR-34a的表達(dá)量與miR-200a和miR-205的表達(dá)量無關(guān)（P＞0.05）。

2.34 種miRNAs在EOC組織中的表達(dá)以及生存分析結(jié)果FIGO早期組生存率高于FIGO晚期組（P＜0.05），見表3。miR-200a表達(dá)量與EOC預(yù)后相關(guān)，miR-200a低表達(dá)患者PFS更短（P=0.035），與患者OS無明顯關(guān)系（P＞0.05）；miR-141、miR-205及miR-34a與患者PFS和OS均無關(guān)（P＞0.05），見圖1、表3。

2.4 miR-200a及臨床指標(biāo)與患者預(yù)后的Cox回歸分析以年齡（歲，＜55=0，≥55=1），F(xiàn)IGO分期（Ⅰ～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1），減瘤術(shù)殘余瘤直徑（cm，≤2=0，＞2=1），化療（是=0，否=1），4種miRNAs（低表達(dá)=0，高表達(dá)=1）為自變量，患者PFS或OS為因變量，應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸顯示，年齡、FIGO分期和miR-200a是EOC患者PFS和OS的獨(dú)立影響因素，見表4。

Tab.3 Univariate analysis of prognosis factors in 44 patients with EOS表3 44例EOC患者生存資料的單因素分析

Fig.1 Survival curves of expressions of 4 miRNAs and the relationship between them and prognosis in patients with EOS圖1 4種miRNAs表達(dá)水平與EOC患者預(yù)后關(guān)系的生存曲線

3 討論

miRNAs是一類長約22個(gè)單位的核苷酸，通過特異性地與靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)（3′-UTR）互補(bǔ)結(jié)合，從而降解或抑制mRNA翻譯，進(jìn)而調(diào)控靶基因［7］。研究表明，miRNAs可以通過調(diào)控EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或通路基因從而參與EMT過程［8］。本研究所涉及到的4種miRNAs參與了已經(jīng)證實(shí)的與EMT密切相關(guān)的ZEBs/miR-200、miR-205和SNAIL1/miR-34反饋回路［5，8］。

miR-200a和miR-141同屬于miR-200家族并有著相同的“種子區(qū)”序列，故調(diào)控功能相似——通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制抑制ZEB1/ZEB2的表達(dá)，增加E-cadherin的表達(dá)，從而抑制EMT［9］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO晚期組miR-141的表達(dá)高于早期組。雖然miR-200a在FIGO早期組和晚期組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其表達(dá)量晚期組高于早期組，且miR-141與miR-200a的表達(dá)呈正相關(guān)。miR-200a位于1號(hào)染色體，而miR-141位于12號(hào)染色體［9］，故二者表達(dá)的相關(guān)性不是因?yàn)槲恢孟嘟蛴兄餐那绑w而共表達(dá)，而可能是受到同樣的上游調(diào)控機(jī)制。本研究生存分析結(jié)果顯示，miR-200a表達(dá)低EOC患者預(yù)后差，考慮原因?yàn)椋阂环矫婵赡芤驗(yàn)閙iR-200家族在EOC發(fā)展過程中表現(xiàn)出復(fù)雜的時(shí)相性，即EOC早期，miR-200低表達(dá)有助于細(xì)胞獲得侵襲性，但已經(jīng)轉(zhuǎn)移了的細(xì)胞需要重新獲得上皮表型，有助于腫瘤細(xì)胞克隆形成和生長，此時(shí)miR-200家族可能重新表達(dá)增高［10］；另一方面EOC的不同發(fā)展階段miR-200家族的功能不是完全一致，miR-141和miR-200a在未治療的情況下可以抑制p38α，從而增加腫瘤細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而癌組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)誘導(dǎo)miR-200a和miR-141高表達(dá)，miR-200a和miR-141高表達(dá)又能增加患者對(duì)紫杉醇的敏感性，抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。在EOC組織中高表達(dá)的miR-200a可能通過增加化療敏感性和抑制EMT等多種調(diào)控方式提示患者預(yù)后良好。

Tab.4 Multivariate analysis of prognosis factors in 44 patients with EOS表4 44例EOS患者生存資料的多因素分析

miR-205是一個(gè)功能上與miR-200家族相似，表達(dá)與miR-200家族相關(guān)的miRNA，同樣也可通過抑制ZEB1表達(dá)扮演一個(gè)EMT的負(fù)性抑制因子［12］。本研究顯示，miR-205表達(dá)與miR-200a和miR-141呈正相關(guān)；生存分析顯示，隨著EOC的進(jìn)展，miR-205表達(dá)升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明其可能與患者預(yù)后無關(guān)。不同于在多數(shù)腫瘤中低表達(dá)，高表達(dá)的miR-205在EOC中可能存在另一種調(diào)控機(jī)制，miR-205能夠通過作用于ESRRG、Ez?rin和Lamin A/C等靶基因，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲遷移［13-14］。筆者認(rèn)為，這可能進(jìn)一步證實(shí)了miR?NAs的表達(dá)存在組織特異性和功能多樣性。

miR-34a是miR-34家族成員之一，而此家族與腫瘤抑制蛋白P53有著正反饋調(diào)節(jié)關(guān)系［15］，在EOC以及大多數(shù)腫瘤中充當(dāng)著抑癌基因的角色［16-17］。Siemens等［18］研究顯示，miR-34a可以通過下調(diào)SNAIL而抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT，從而逆轉(zhuǎn)EMT過程。本研究結(jié)果未顯示miR-34a與EOC患者FIGO分期和預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，miR-141在EOC晚期患者中表達(dá)升高，miR-200a低表達(dá)提示患者預(yù)后差，是EOC的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，有望成為指導(dǎo)臨床預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

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（2015-04-28收稿2015-05-07修回）

（本文編輯陸榮展）

Expression and clinical significance of four miRNAs in epithelial ovarian cancer

LIU Jiayu1，2，ZHAO Yanrui1，ZHANG Lina1，3，YAN Ye4，ZHENG Hong1△
1 Department of Epidemiology and Biostatistics，Tianjin Medical University Cancer Hospital and Institute，National Clinical Research Center of Cancer，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2 Gradute School，Tianjin Medical University；3 Department of Breast Surgery，Tianjin Medical University Cancer Hospital and Institute；4 Department of Gynecology and Obstetrics，Tianjin Medical University General Hospital△

ObjectiveTo determine the expressions of miR-200a，miR-141，miR-205 and miR-34a in epithelial ovarian cancer（EOC）samples and to explore their clinical significance.MethodsAccording to FIGO staging，44 EOC pa?tients were divided into two groups：early FIGO stage（stageⅠ-Ⅱ，n=15）and late FIGO stage（stageⅢ-Ⅳ，n=29）.Expres?sions of 4 miRNAs were detected by real time quantitative PCR，and were compared between two groups.The correlation of 4 miRNAs was calculated.EOC patients were divided into high miRNA expression group and low expression group according to the median value of miRNAs expression.Kaplan-Meier survival analysis and Cox multivariate analysis were used to com?pare the age，F(xiàn)IGO state，tumor residual after operation and post-operative chemotherapy of ovarian cancer between two groups.ResultsThe expression of miR-141 was elevated in stagesⅢandⅣcompared with that of stagesⅠandⅡ（P= 0.036）.There was a positive correlation between expression of miR-141，miR-200a and miR-205，but a negative correlation with miR-34a（P＜0.05）.There was a positive correlation between miR-200a and miR-205（P＜0.05）.Lower miR-200a ex?pression was associated with shorter progress free survival in ovarian cancer analyzed by log-rank test（P=0.035）.The sur?vival rate was significantly higher in FIGO stagesⅠandⅡthan that of FIGO stagesⅢandⅣ（P＜0.05）.Cox regression analysis revealed that miR-200a，F(xiàn)IGO stage and age were influential factors of overall survival time and progress-free sur?vival time of ovarian cancer，while miR-141，miR-205，miR-34a and tumor residual after operation and post-operative che?motherapy were not influential factors.ConclusionThe expression of miR-200a is closely correlated with the progress and prognosis of ovarian cancer and may be used as an independent indicator for ovarian cancer prognosis.

microRNAs；ovarian neoplasms；epithelial-mesenchymal transition；epithelial；miR-200a；miR-141；miR-205；miR-34a

R737.31；R34-33

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.0010

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81072363）

1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，腫瘤研究所腫瘤分子流行病與生物統(tǒng)計(jì)研究室，國家腫瘤臨床研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300060）；2天津醫(yī)科大學(xué)研究生院；3天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺外科；4天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科

劉佳宇（1989），女，碩士在讀，主要從事腫瘤分子流行病學(xué)研究

△通訊作者E-mail：zhengh64@aliyun.com