郭 普，賀曉珊，梅傳忠，李興武，劉雙成，沈繼龍

2.蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，蚌埠 233003；

3.安徽病原生物學(xué)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室和人獸共患病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽醫(yī)科大學(xué)病原學(xué)教研室，合肥 230032

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染重要的條件致病菌，常引起肺炎、尿路感染、腦膜炎、敗血癥等[1－2]。近年來，由肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染不斷增多，尤其在ICU，已成為常見的醫(yī)院感染病原菌，特別是目前大劑量廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用甚至濫用，使得該菌的多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來極大的困難。為了解我院肺炎克雷伯菌的耐藥特性及耐藥基因分布情況，筆者對(duì)我院2012年1月至2013年5月分離的肺炎克雷伯菌進(jìn)行了β－內(nèi)酰胺酶及整合子耐藥基因檢測(cè)并進(jìn)行耐藥分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 收集2012年1月－2013年5月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌242株（去除同一患者同一部位的重復(fù)菌株），其中來自痰標(biāo)本 104株 （42.98%）、創(chuàng)面分泌物70株（28.93%）、尿液24株（9.29%）、全血和骨髓24株（9.29%）、其它標(biāo)本20株（8.26%）。標(biāo)本的采集、送檢、處理依據(jù)第3版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》。

1.2 儀器及試劑 VITEK 2－compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)：法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)；PCR擴(kuò)增儀：德國(guó)Biomera產(chǎn)品；電泳儀：美國(guó)Bio－Rad公司產(chǎn)品。細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)卡為儀器原裝配套產(chǎn)品，EX－taq聚合酶和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)均為大連寶生物公司產(chǎn)品。質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603，大腸埃希菌ATCC25922購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心。陽性對(duì)照的 TEM、SHV、OXA－10、KPC－gp、KPC－qc、DHA、intI－1、intI－2、intI－3產(chǎn)酶菌株由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院沈繼錄博士惠贈(zèng)。

1.3 細(xì)菌鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn) 所有細(xì)菌的鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)采用法國(guó)的VITEK 2－compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)。

1.4 PCR擴(kuò)增和序列分析

1.4.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank公布的blaTEM、blaSHV、blaOXA－10、KPC－gp、KPC－qc、DHA、intI－1、intI－2、intI－3 的 DNA 序 列，使 用Prime Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列及退火溫度、產(chǎn)物大小見表1。

表1 各基因型片段引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequences，annealing temperature and products size of the genotypes

1.4.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體積為50μL，反應(yīng)體系：EX Taq酶0.5μL、10×PCR 緩沖液 （含Mg2＋）5μL、dNTP混合物4μL、模板DNA 3μL、上下游引物各1μL（10μm／μL）、超純水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94。C預(yù)變性7min，94。C40s、63。C 40s、72。C40s、30個(gè)循環(huán)，72。C10min、4。C保溫。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照及陰性對(duì)照，將擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠電泳、成像。

2 結(jié) 果

2.1 感染部位 242株肺炎克雷伯菌主要來自呼吸道標(biāo)本和手術(shù)切口為主，分別占42.98%和28.93%。

2.2 感染病區(qū)分布 242株肺炎克雷伯菌在ICU分離率最高，其次為急診外科，分別為30.17%和7.02%，其在不同科室的具體分布見表2。

表2 242株肺炎克雷伯菌臨床科室分布Tab.2 Distribution of 242 Klebsiella pneumonia strains isolated from clincal departments.

2.2 藥敏分析 242株肺炎克雷伯菌對(duì)16種抗生素存在不同程度的耐藥，其中氨曲南、頭孢唑啉、氨芐西林／舒巴坦、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥率較高，耐藥率分別為76.86%、65.70%、63.64%、62.40%和59.92%，對(duì)亞胺培南、丁胺卡那、厄他培南和哌拉西林／他唑巴坦較為敏感，耐藥率分別為：17.77%、18.88%、18.88%、和23.55%。見表3。

2.3 耐藥基因檢測(cè) β－內(nèi)酰胺酶耐藥基因中ESBLs基因陽性155株，占64.05%，主要為TEM型和SHV型，兩者同時(shí)存在的菌株有114株，占產(chǎn)ESBLs基因菌株的 73.55%（114／155）。其次為KPC基因86株，占35.54%；AmpC基因43株，占17.77%，全部為DHA型。整合子基因128株，占52.89%，以整合子1（intI－1）為主，共檢出120株，占49.59%?；蚍植家姳?。部分PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖片見圖1。

表3 242株肺炎克雷伯菌對(duì)16種抗生素耐藥率Tab.3 Drug－resistant rate of 242 Klebsiella pneumonia strains against 16kinds of antibiotics

表4 242株肺炎克雷伯菌的耐藥基因分布Tab.4 Drug－resistant gene distribution of 242 Klebsiella pneumonia strains

圖1 DHA和intI1耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR analysis of DHA genotype and intI1

3 討 論

肺炎克雷伯菌是導(dǎo)致醫(yī)院感染常見和重要的條件致病菌，近年來，隨著新型廣譜抗菌藥物在臨床廣泛使用，各種侵入性診療活動(dòng)的增加，肺炎克雷伯菌在臨床的感染率及對(duì)多種抗生素的耐藥率呈逐漸上升的趨勢(shì)，部分菌株甚至對(duì)高效、廣譜的亞胺培南等碳青霉烯類抗生素也產(chǎn)生了耐藥性，出現(xiàn)了多重耐藥甚至泛耐藥菌株，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)[3－5]。肺炎克雷伯菌可引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行。目前國(guó)內(nèi)外都有引起暴發(fā)流行的相關(guān)報(bào)道[6－8]，Snitkin.ES等報(bào)道美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院臨床中心發(fā)生了碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，國(guó)內(nèi)張曉蕓等也報(bào)道了泛耐藥肺炎克雷伯菌引起ICU醫(yī)院感染的暴發(fā)流行。因此，對(duì)肺炎克雷伯菌耐藥菌株的耐藥機(jī)制進(jìn)行檢測(cè)，明確其耐藥特性，以指導(dǎo)臨床合理用藥，減少耐藥發(fā)生，預(yù)防醫(yī)院感染的暴發(fā)流行成為迫切需要解決的問題。

本研究結(jié)果顯示，我院肺炎克雷伯菌的感染主要分布在ICU、外科病區(qū)及呼吸病科，感染部位以呼吸道感染為主占42.98%，其次為手術(shù)切口占28.93%，與相關(guān)報(bào)道相近[1]。ICU 及呼吸病科收治的患者大多在嚴(yán)重的基礎(chǔ)病、自身免疫水平低下、長(zhǎng)期大量使用多種抗生素、住院時(shí)間長(zhǎng)，氣管切開、氣管插管、呼吸機(jī)的使用等侵入性診療操作較多，破壞了機(jī)體的防御屏障，使得呼吸道分泌功能減弱，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌的感染率高于其它病區(qū)。外科手術(shù)病區(qū)也常易受該菌的感染。值得關(guān)注的是該菌曾多次短時(shí)間內(nèi)在ICU同一病區(qū)、同一病房?jī)?nèi)發(fā)生感染，均為泛耐藥菌，鑒定號(hào)也相同，說明引起感染的細(xì)菌可能來自同一克隆，有引起醫(yī)院感染暴發(fā)流行的傾向。

從藥敏結(jié)果看，242株肺炎克雷伯菌對(duì)16種抗生素存在不同程度的耐藥，其中β－內(nèi)酰胺類抗生素氨曲南、頭孢唑啉、氨芐西林／舒巴坦、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥率較高，耐藥率都高于60.00%，碳青霉烯類抗生素亞胺培南、厄他培南耐藥率也分別達(dá)到了17.77%、18.18%，周榮[1]等研究發(fā)現(xiàn) 2008－2011年重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院分離的855株肺炎克雷伯菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率除頭孢唑林其余均低于50.00%，亞胺培南和厄他培南耐藥率僅為6.30%、4.20%。2012年中國(guó)CHINET報(bào)道[2]肺炎克雷伯菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率14.1%～53.7%，亞胺培南和厄他培南耐藥率為8.90%、12.90%，均略低于我院耐藥結(jié)果。文獻(xiàn)報(bào)道，產(chǎn)ESBLs、KPC、AmpC等β－內(nèi)酰胺酶是肺炎克雷伯菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素主要耐藥機(jī)制之一[9－10]。本研究發(fā)現(xiàn)242株耐藥菌株中 ESBLs基因陽性155株，占64.05%；其次為KPC基因86株，占35.54%；AmpC基因43株，占17.77%，全部為DHA基因。在ESBLs基因中主要為TEM型和SHV型，與蔡俊、雷金娥和Freitas F等報(bào)道結(jié)果相近[9－11]。本組細(xì)菌中整合子基因陽性的有128株，占52.89%，以整合子1（intI－1）為主，共檢出120株，占49.59%，略低于毛璞等報(bào)道的結(jié)果57.91%[12]。整合子屬可移動(dòng)的基因元件，能位于細(xì)菌的質(zhì)粒和染色體上，在細(xì)菌耐藥及耐藥基因的水平傳播中具有重要的意義，且一個(gè)整合子可捕獲多個(gè)耐藥基因盒，表達(dá)對(duì)不同抗生素的耐藥性。我院分離的多重耐藥的肺炎克雷伯菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類及含酶抑制劑的抗生素耐藥率高，除了和產(chǎn)生各種β－內(nèi)酰胺酶、整合子的水平傳播有關(guān)，可能還存在高表達(dá)的外排泵系統(tǒng)、外膜蛋白的丟失等其他耐藥機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。此外，本組細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類的抗生素耐藥率也高于50.00%，具體耐藥機(jī)制也有待于進(jìn)一步研究。本組肺炎克雷伯菌亞胺培南、丁胺卡那、厄他培南和哌拉西林／他唑巴坦較為敏感，耐藥率均小于30.00%，可以作為經(jīng)驗(yàn)性治療選藥。

綜上所述，我院肺炎克雷伯菌對(duì)多種抗生素耐藥率高，耐藥機(jī)制復(fù)雜，臨床應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果規(guī)范合理使用抗生素，同時(shí)加強(qiáng)醫(yī)院感染的監(jiān)控，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。

[1]Zhou R，Zhu WM，Huang WX，et al.Distribution and antibiotic resistance of 855isolates ofKlebsiellapneumoniae[J].Chin J Antibiotics，2013，38（5）：363－367.（in Chinese）周蓉，朱衛(wèi)民，黃文祥，等.855株肺炎克雷伯菌感染的臨床分布及耐藥性分析[J].中國(guó)抗生素雜志，2013，38（5）：363－367.

[2]Wang F，Zhu DM，Hu FP，et al.2012CHINET surveillance of bacterial resistance in China[J].Chin J Infect Chemother，2013，139（5）：321－330.（in Chinese）汪復(fù)，朱德妹，胡付品，等.2012年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志，2013，13（5）：321－330.

[3]Li YH，Pang F，Jia XQ，et al.Epidemiology analysis and resistance observation on the antibiotics of carbapenem－non－susceptibleKlebsiellapneumoniae[J].Shandong Med J，2013，53（7）：57－59.（in Chinese）李艷華，龐峰，賈秀芹，等.碳青霉烯類抗菌藥物敏感性降低的肺炎克雷伯菌流行病學(xué)分析及耐藥性觀察[J].山東醫(yī)藥，2013，53（7）：57－59.

[4]Yang JH，Lv Y.Current prevalence and epidemiologic analysis of carbapenem resistant ofKlebsiellapneumoniaein China[J].Chin J Clin Pharmacol，2012，28（5）：323－326.（in Chinese）楊金輝，呂媛.中國(guó)肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素耐藥現(xiàn)狀和流行病學(xué)分析[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2012，28（5）：323－326.

[5]Weng XB，Mi ZH.Emergence of four kinds of beta－lactamace genes in an isolate of MDRKlebsiellapneumoniaein china[J].Chin J Zoonoses，2014，30（3）：329－331.（in Chinese）

[6]Snitkin ES，Zelazny AM，Thomas PJ，et al.Tracking a hospital outbreak of carbapenem－resistantKlebsiellapneumoniaewith whole－genome sequencing[J].Sci Transl Med，2012，4（148）：148ra116.DOI：10.1126／scitranslmed.3004129

[7]Cuzon G，Naas T，Demachy MC，et al.Nosocomial outbreak ofKlebsiellapneumoniaeharbouring bla（KPC－3）in France subsequent to a patient transfer from Italy[J].Int J Antimicrob A－gents，2012，9（5）：448－449.DOI：10.1016／j.ijantimicag.2012.01.008

[8]Zhang XY，Tan XY，Li DH，et al.Outbreak and control of hospital infection of Pandrug－resistantKlebsiellapneumoniaein ICU[J].Chin J Nosocomiol，2012，22（1）：79－80.（in Chinese）張曉蕓，譚曉燕，李冬麗，等.ICU泛耐藥肺炎克雷伯菌肺部感染暴發(fā)與控制[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（1）：79－80.

[9]Cai J.Drug resistance and genotype of plasmid AmpC enzyme inKlebsiellapneumoniaein a hospital[J].Chongqing Med，2012，41（24）：2510－2512.（in Chinese）蔡俊.某院肺炎克雷伯菌產(chǎn)質(zhì)粒AmpC酶基因型及耐藥性研究[J].重慶醫(yī)藥，2012，41（24）：2510－2512.

[10]Lei JE，Da R，Zhang KG，et al.Genotypes of extended spectrum beta－lactamases in clinical isolates ofKlebsiellapneumoniae[J].J Xi’an Jiaotong Univ：Med Sc，2012，33（6）：702－706.（in Chinese）雷金娥，答嶸，張凱歌，等.肺炎克雷伯菌產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶的基因分型[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，33（6）：702－706.

[11]Freitas F，Machado E，Ribeiro TG，et al.Long－term dissemination of acquired AmpCβ－lactamases amongKlebsiellaspp.andEscherichiacoliin Portuguese clinical settings[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2014，33（4）：551－558.DOI：10.1007／s10096－013－1983－9

[12]Mao P，F(xiàn)u W，Qiu GX，et al.Detection and characterization of class I integrons inKlebsiellapneumoniae[J].Chin J Antibiotics，2013，38（3）：235－238.（in Chinese）毛璞，傅威，邱桂霞，等.肺炎克雷伯菌I型整合子的檢測(cè)與鑒定[J].中國(guó)抗生素雜志，2013，38（3）：235－238.