陳 光，劉 蕾，王芳芳，羅 蘭，蘇菊香，蔡連順，代 月

2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，佳木斯 154000；Email：misschenguang75＠163.com

瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的全球感染性疾病。據(jù)2013年WHO報告，約34億人受到瘧疾威脅，每年約2.07億例瘧疾病例，造成大約62.7萬例瘧疾死亡[1]。瘧疾已成為世界廣泛關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題之一，給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹藝?yán)重的健康危害和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2－3]。然而關(guān)于瘧疾發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚，探索瘧疾發(fā)生的免疫、細(xì)胞和分子機(jī)制仍具有重要的實(shí)際意義。

前炎性／抗炎性免疫應(yīng)答之間的平衡是清除瘧原蟲而不引起宿主嚴(yán)重病理損傷的關(guān)鍵。不同類型免疫應(yīng)答的啟動和強(qiáng)度又是決定感染結(jié)局的關(guān)鍵。免疫調(diào)節(jié)平衡作用關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素之一與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）／樹突細(xì)胞（dendritic cells，DC）之間的相互作用密切相關(guān)。相關(guān)文獻(xiàn)報道，Tregs細(xì)胞能夠調(diào)控DCs的細(xì)胞表型和細(xì)胞因子表達(dá)譜，改變DCs的生物學(xué)活性。Tregs細(xì)胞識別和結(jié)合DCs后可抑制DCs的活化、成熟和刺激T細(xì)胞增殖的能力[4]。然而關(guān)于瘧疾感染后Tregs與DCs間的相互關(guān)系無相關(guān)文獻(xiàn)報道。為此本實(shí)驗(yàn)利用P.y17XL感染鼠瘧模型，對比分析抗原刺激下DCs及其Tregs表型和功能的變化特點(diǎn)，特別是采用Tregs消除鼠觀察DCs表型和功能的變化，確定Tregs對DCs的調(diào)控作用，這一研究無疑將為瘧疾等感染性疾病的有效控制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瘧原蟲及實(shí)驗(yàn)動物感染 6－8周齡、雌性BALB／c小鼠（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，許可證編號：SCXK京2004－0001），經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL（日本愛嬡大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈）寄生的紅細(xì)胞。于感染后不同時間采小鼠尾靜脈血，制備薄血膜，Giemsa染色，計數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.2 Tregs消除小鼠模型的構(gòu)建 BALB／c小鼠分別于感染前1d和感染后1d腹腔注射1mg CD25單 抗 （7D4，rat IgM；BioExpress .PC61，rat IgG1；eBioscience），腹腔注射PBS小鼠作為對照組。分別于感染0d、3d和5d常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，流式分析確認(rèn)CD25的消除效率。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測DCs亞群數(shù)量 無菌取出小鼠脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×106／mL。每份樣品用抗 CD11c－FITC、CD11b－PE和CD45R／220－PerCP 單 抗進(jìn)行三色分析，檢 測DCs亞群數(shù)量變化，另設(shè)陰性對照管。在預(yù)先加入FcγIII／II封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1mL，再加入抗CD11c－FITC單抗、抗CD11b－PE單抗和抗CD45R／B220－PerCP單抗進(jìn)行表面染色，離心去上清后，用0.5mL PBS重懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測DCs表面分子表達(dá) CD11c－FITC標(biāo)記 DCs后，抗 CD80－PE、CD86－PE、MHCII－PE三種熒光抗體分別標(biāo)記，F(xiàn)ACS檢測DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHC－II分子的表達(dá)水平；同時用FITC rat IgG2b作為同型對照。利用流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美國B＆D公司），使用前向散射角（FSC）及側(cè)向散射角（SSC）確定淋巴細(xì)胞群，應(yīng)用FACSCELLQUEST軟件，每個樣品分析10 000個細(xì)胞，以陰性對照為參考，將對照管所示的非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點(diǎn)陣圖顯示，記錄DCs表面分子表達(dá)水平的百分率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測DCs分泌IL－10的水平 每份樣本用CD11c－FITC和IL－10－PE進(jìn)行雙色分析，另設(shè)陰性對照管。流式細(xì)胞儀專用染色管預(yù)先加入FcγⅢ／Ⅱ封閉抗體，取新鮮制備的1×106／mL脾細(xì)胞懸液0.1mL，37。C條件下PMA和伊屋諾霉素刺激2h后加入Golgi Stop共同培養(yǎng)4h，3%FCS洗滌后加入FITC－anti－CD11c熒光抗體孵育30 min，3%FCS洗滌后加入固定透膜劑孵育，然后加入PE－anti－IL－10熒光抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。同時用FITC rat IgG2b作為同型對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件，雙側(cè)t檢驗(yàn)分析比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異。P小于或等于0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1P.y17XL感染BALB／c小鼠Tregs消除效果觀察 與正常感染小鼠相比，7D4／PC61阻斷組小鼠Tregs數(shù)量均出現(xiàn)有意義的較少，在感染后3d和5d分別減少79%、79%和84%、45%（圖1）。另外，兩種消除方法相比，感染后第5d差異有顯著性（P＜0.05）。

2.2P.y17XL感染BALB／c小鼠Tregs消除后原蟲血癥水平及生存率 于感染后第3d，P.y17XL感染BALB／c小鼠外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞。感染后第4d，紅細(xì)胞感染率約為5%～10%。隨后，BALB／c小鼠原蟲血癥水平迅速升高，于感染后第6d紅細(xì)胞感染率高達(dá)50%，小鼠于感染后第6d及次日全部死亡；而Tregs消除小鼠原蟲血癥水平上升緩慢，感染后第4d紅細(xì)胞感染率僅為1%以下。感染后第7d／8d紅細(xì)胞感染率達(dá)峰值，小鼠全部死亡（圖2A，2B）。

圖1 P.y17XL感染BALB／c小鼠Tregs消除效果。結(jié)果以3只小鼠Tregsx±s表示。Fig.1 Effect of Tregs depletion in BALB／c mice by Flow cytometric.

圖2 Tregs消除小鼠不同時間原蟲血癥水平及生存率Fig.2 Parasitemia and survival rate of Tregs blocked mice in different time after infection.

2.3P.y17XL感染BALB／c小鼠 Tregs消除后DCs亞群的數(shù)量 與正常感染小鼠相比，7D4／PC61阻斷組小鼠在感染后3dDC1／DC2細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.05），然而 DC1／DC2的數(shù)量于感染后5d均減少（P＜0.05）（圖3A，3B）。

2.4P.y17XL感染BALB／c小鼠 Tregs消除后DCs表面分子的表達(dá)水平 與正常感染小鼠相比，7D4／PC61阻斷組小鼠在感染后3dMHC－II分子、CD80和CD86的表達(dá)水平均有意義的增高，感染后5dCD86仍持續(xù)增高，而MHC－II分子和CD80的表達(dá)水平則減少（P＜0.05）（圖4A，4B，4C）。

2.5P.y17XL感染BALB／c小鼠Tregs消除后分泌IL－10的DCs數(shù)量 與正常感染小鼠相比，7D4／PC61阻斷組小鼠在感染后3d和5d分泌IL－10的DCs數(shù)量增加有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；另外，兩種Tregs阻斷方法相比，PC61阻斷后分泌IL－10的DCs數(shù)量高于7D4阻斷組（P＜0.01）（圖5）。

圖3 Tregs消除小鼠感染后不同時間脾臟DC1／DC2的數(shù)量Fig.3 Percentage of DC1and DC2in supernatants from Tregs blocked mice in different time after infection.

3 討 論

相關(guān)文獻(xiàn)報道，Tregs細(xì)胞在原蟲感染時具有兩方面的作用：一方面是通過控制過度的免疫反應(yīng)保護(hù)宿主，避免機(jī)體受到嚴(yán)重的免疫病理損害；另一方面卻會增加寄生蟲的存活機(jī)率，阻礙機(jī)體有效清除病原體。Tregs可通過表面膜分子與其它細(xì)胞直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子IL－10、TGF－β和IL－35等方式，抑制體內(nèi)多種免疫細(xì)胞的活化和增殖[5－7]，削弱炎癥效應(yīng)，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。

圖4 Tregs消除小鼠感染后不同時間脾臟DC MHC－II、CD80和CD86分子表達(dá)水平Fig.4 Levels of MHC－II，CD80and CD86expression in DC in supernatants from Tregs blocked mice in different time after infection.

DCs在誘導(dǎo)固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，同時作為活化初始T細(xì)胞的唯一抗原提呈細(xì)胞（APC），是決定Th細(xì)胞應(yīng)答形式、強(qiáng)度和效應(yīng)的關(guān)鍵[8]。瘧原蟲感染的紅細(xì)胞（pRBC）一方面可誘導(dǎo)DCs刺激初始T細(xì)胞分化為分泌IFN－γ的 CD4＋Th1細(xì)胞、分泌IL－4的 CD4＋Th2細(xì)胞或分泌IL－10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；另一方面pRBC的數(shù)量達(dá)到最高時反而抑制DCs的成熟，導(dǎo)致其功能受損[9]，影響瘧疾發(fā)展方向。相關(guān)文獻(xiàn)報道，DCs能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子，Tregs的抑制作用又能阻斷DCs的成熟[10]。

圖5 Tregs消除小鼠感染后不同時間脾臟分泌IL－10的DCs數(shù)量Fig.5 Percentage of DC－secreting－IL－10in supernatants from Tregs blocked mice in different time after infection.

為了確定P.y17XL感染BALB／c小鼠DCs功能受損是否與Tregs數(shù)量增加有一定關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Tregs體內(nèi)消除的P.y17XL感染BALB／c小鼠模型，結(jié)果顯示：與正常感染組小鼠相比，Tregs消除組小鼠于感染后第3dDCs亞群，MHC－II、CD80和CD86的表達(dá)均增加，第5dDCs亞群數(shù)量、MHC－II和CD80表面分子的表達(dá)均明顯減少；然而分泌IL－10的DCs數(shù)量于感染后第5d明顯增高，是同天感染鼠的1／3.5倍。由此說明，Tregs部分參與了瘧原蟲感染早期DCs的成熟和活化，通過降低其表面分子的表達(dá)和IL－10的分泌抑制了DCs的免疫功能而使DCs功能受損。Tregs消除組小鼠感染后第5dDCs的成熟明顯被抑制，可能與pRBC數(shù)量急劇增加后抑制DCs成熟密切相關(guān)。

另外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種anti－CD25mAb體內(nèi)阻斷Tregs效果有著明顯的差異。7D4能長期有效的阻斷CD25的表達(dá)，而PC61僅能短期內(nèi)維持CD25的低表達(dá)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，7D4能迅速的降低CD25hi細(xì)胞的數(shù)量，而PC61／PC61＋7D4則效果不理想[11]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，如果使用PC61單克隆抗體構(gòu)建Tregs消除鼠瘧模型，需要對模型鼠短期內(nèi)多次注射，以保障實(shí)驗(yàn)期間CD25的低表達(dá)。綜上所述，P.y17XL感染早期，BALB／c小鼠Tregs數(shù)量的升高與DCs功能受損具有相關(guān)性。Tregs能抑制DCs的免疫功能，這一現(xiàn)象可能與Tregs調(diào)控DCs的亞群、表型和細(xì)胞因子分泌模式等方面有關(guān)，但其確切的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步闡明。

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