齊 萌，劉利敏，黃 磊，徐利納，張素梅，張龍現(xiàn)

隱孢子蟲?。–ryptosporidiosis）是由隱孢子蟲（Cryptosporidium）引起的一種重要的機會性人獸共患原蟲病，為全球性重要的食源性／水源性疾病之一[1]。隱孢子蟲已公認的有效種有27個，多數(shù)種類具有宿主特異性，其中鼠隱孢子蟲（Cryptosporidiummuris）為人獸共患蟲種，主要寄生于嚙齒類動物胃腺粘膜上皮細胞，包括人在內(nèi)的其他多種哺乳動物也有感染報道[1－4]。禽類中，曾有報道在茶色蟆口鴟和夜鷹糞便中檢測到C.muris，但是否為糞便被C.muris卵囊污染尚不確定[5]。也有調(diào)查在蛇類糞便中檢測到C.muris和泰澤隱孢子蟲（Cryptosporidiumtyzzeri），調(diào)查者認為該兩種隱孢子蟲并非寄生于蛇消化道上皮細胞，而是蛇攝食隱孢子蟲陽性的嚙齒類動物，卵囊通過糞便排出體外[6－7]。

非洲鴕鳥屬鳥綱鴕形目鴕鳥科，是現(xiàn)存體型最大的平胸鳥類，其主要感染貝氏隱孢子蟲（Cryptosporidiumbaileyi）、火雞隱孢子蟲（Cryptosporidiummeleagridis）、隱孢子蟲禽基因型II（avian genotype II）和一個隱孢子蟲未定種[8－9]。目前已有的研究發(fā)現(xiàn)C.muris僅感染哺乳動物，本研究從非洲鴕鳥糞便中分離到一種隱孢子蟲卵囊，經(jīng)形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定為C.muris。為了解鴕鳥源C.muris傳播能力及生物學特征，本試驗用鴕鳥源C.muris接種羅曼雛雞、Balb／c鼠和蒙古沙鼠，觀察動物感染后臨床癥狀和排卵囊規(guī)律，通過組織學觀察其宿主適應性和寄生部位等方面，以期為隱孢子蟲的分類地位及生物學特性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵囊來源C.muris卵囊分離自鄭州某鴕鳥養(yǎng)殖場10歲以上長期排卵囊的鴕鳥。

1.1.2 試驗動物與分組 購自鄭州牧業(yè)工程高等專科學校孵化場1日齡羅曼雛雞20只，10只為感染組，10只為不感染對照組；購自河南省試驗動物中心20日齡Balb／c鼠15只，10只為感染組，5只為不感染對照組；購自首都醫(yī)科大學15只20日齡蒙古沙鼠，10只為感染組，5只為不感染對照組。各試驗動物均于感染前連續(xù)糞檢3d，無腸道寄生蟲感染者用于本試驗。感染組動物每只接種卵囊劑量為1.0×106個／mL，不感染對照組每只經(jīng)口灌胃等體積蒸餾水。動物接種卵囊后每天收集糞便檢查卵囊。

1.1.3 動物組織樣品 感染成功的動物于排卵囊高峰期分別剖殺，取其胃、十二指腸和空腸組織樣品，光鏡樣品置10%中性福爾馬林固定液中，常溫保存?zhèn)溆?，電鏡樣品保存于pH＝7.2的2.5%戊二醛溶液中固定，置4。C冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 卵囊檢查 采用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法檢查卵囊，用微分干涉差顯微鏡進行拍照。

1.2.2 卵囊收集與計數(shù) 采用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法收集卵囊。用血細胞計數(shù)板進行卵囊計數(shù)，計算每克糞便中的隱孢子蟲卵囊數(shù)（OPG）。

1.2.3 DNA提取 采用日本TOYOBO公司生產(chǎn)的Mag Extractor－Genome提取試劑盒 （購自北京夏斯生物技術(shù)有限公司），按照其說明書提取流程進行操作。

1.2.4 PCR擴增 18SrRNA基因引物設計和反應程序參照Xiao等[10]的報道，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.5 測序 由北京諾賽基因有限公司完成。

1.2.6 組織樣品觀察 光鏡樣品按常規(guī)石蠟組織切片樣品處理方法脫水、HE染色、顯微鏡觀察照相；電鏡樣品按常規(guī)掃描電鏡樣品處理方法脫水、置換乙醇、干燥和噴金，觀察照相。

2 結(jié) 果

2.1C.muris形態(tài)學觀察 飽和蔗糖溶液中卵囊呈長橢圓形，淡藍色，卵囊周圍顯黃綠色，部分卵囊囊壁凹陷。微分干涉差顯微鏡下，卵囊呈卵圓形或近圓形，測量76個卵囊，平均卵囊大小為（7.41±0.12）μm×（5.70±0.07）μm，卵囊指數(shù)為1.30。見圖1。

圖1 微分干涉顯微鏡下的鼠隱孢子蟲卵囊 （比例尺：10 μm）Fig.1 Cryptosporidium muris oocysts under differential interference contrast microscopy（Scale bars：10μm）

2.2 18SrRNA基因的PCR擴增和測序 PCR成功擴增出隱孢子蟲分離株的18SrRNA基因片段，大小為830～850bp。將PCR進行測序，對其序列進行Clustalx比對，與C.muris同源性為100%，鑒定出該隱孢子蟲分離株為C.muris。該序列GenBank登錄號為GQ227706。

2.3 動物感染試驗 雛雞接種鴕鳥源C.muris30d內(nèi)，各組雛雞均無C.muris卵囊排出，精神狀態(tài)始終良好，剖檢其胃腸道均正常。C.muris卵囊經(jīng)灌胃接種Balb／c鼠，從感染后第9 d（9days post infection，DPI 9）有卵囊排出至DPI 46結(jié)束。潛隱期為8d，顯露期為37d。排卵囊高峰期在DPI 17－DPI 31，最大 OPG為20.5×104個。感染組與不感染對照組小鼠均無死亡，糞便性狀、食欲、毛質(zhì)和精神狀況良好。詳見圖2。

圖2 Balb／c鼠感染鼠隱孢子蟲排卵囊規(guī)律Fig.2 Development of oocysts shedding of Balb／c mice after inoculation with C.muris oocysts

C.muris卵囊接種蒙古沙鼠后，潛隱期為13 d，DPI 13發(fā)現(xiàn)卵囊排出，沙鼠持續(xù)排出卵囊時間至DPI 85結(jié)束，顯露期72d，排卵囊高峰期在DPI 31－DPI 64，最大OPG為41.5×104個。試驗前后，感染組與不感染對照組蒙古沙鼠均無死亡，糞便性狀、食欲、毛質(zhì)和精神狀況良好。

2.4 組織粘膜涂片改良抗酸染色觀察 分別在Balb／c鼠和蒙古沙鼠感染隱孢子蟲排卵囊高峰期，各剖殺兩只，取胃腸道粘膜涂片，采用改良抗酸染色法進行觀察，十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸和直腸各腸道粘膜涂片中均未發(fā)現(xiàn)C.muris卵囊，僅在鼠胃粘膜涂片中發(fā)現(xiàn)C.muris卵囊。在1 000倍光學顯微鏡下觀察，卵囊在藍綠色背景下呈玫瑰紅色，對比明顯。見圖3。

圖3 經(jīng)改良抗酸染色法染色后的鼠胃粘膜涂片中鼠隱孢子蟲卵囊（1 000×）Fig.3 C.muris oocyst in the mice gastric gland stained by modified acid fast stain（1 000×）

2.5 病理組織學觀察 剖檢可見，感染組Balb／c鼠和蒙古沙鼠的胃和對照組相比，均萎縮變小，內(nèi)容物少，胃壁變薄。通過對組織切片HE染色觀察，結(jié)果在胃腺小凹發(fā)現(xiàn)大量C.muris蟲體寄生，在胃腺內(nèi)，可觀察到C.muris各發(fā)育階段，腸道組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)蟲體，見圖4。對照組未見異常。

2.6 電子掃描顯微鏡觀察 取感染組Balb／c鼠胃組織進行電鏡觀察，在5 000倍掃描電鏡下，胃腺部位發(fā)現(xiàn)大量各階段C.muris蟲體寄生，帶蟲空泡嵌在胃腺粘膜內(nèi)，蟲體在帶蟲空泡內(nèi)發(fā)育，Ⅰ型裂殖體8個裂殖子清晰可見，見圖5。

3 討 論

3.1 鴕鳥自然感染的隱孢子蟲蟲種 1994年，Gajadhar[11]報道鴕鳥可感染隱孢子蟲，顯微鏡觀察其卵囊形態(tài)不同于C.baileyi和C.meleagridis，分離的隱孢子蟲卵囊不能感染乳鼠、雛雞、火雞和鵪鶉，提出該鴕鳥源隱孢子蟲可能是一個新種。2006年，Meireles等[12]報道其發(fā)現(xiàn)的鴕鳥隱孢子蟲分離株與C.baileyi分子遺傳特征有差異，但需對其卵囊的形態(tài)特征和生物學特性進行研究以確定其是否為新的隱孢子蟲種類／基因型。國內(nèi)，孫銘飛等[13]對鴕鳥源隱孢子蟲分離株進行生物學特性研究，結(jié)果顯示獲得的分離株均為C.baileyi，可感染雛雞和幼齡鴕鳥，但不能感染小鼠，主要寄生部位為泄殖腔和法氏囊。Wang等[14]報道鄭州地區(qū)鴕鳥隱孢子蟲感染率為11.7%，主要感染6月齡以下鴕鳥，基于18srRNA基因?qū)?3個隱孢子蟲分離株進行鑒定，均為C.baileyi。本研究從形態(tài)學觀察，分子生物學方法和動物感染試驗證明分離的鴕鳥源隱孢子蟲為C.muris，且長期排卵囊，其在鴕鳥體內(nèi)的寄生部位有待于進一步研究。

3.2C.muris人獸共患性C.muris具有較為廣泛的宿主譜，可感染人、小鼠、倉鼠、松鼠、田鼠、巖貍、雙峰駝、野生白山羊、犬、貓、山狗、非洲蹄兔、短尾猴和豬等多種哺乳動物，在肯尼亞、泰國、法國、秘魯、印度尼西亞和埃及等國的免疫力低下人群中及健康人群中均有感染C.muris的報道[1－4]。先前研究認為，C.muris只感染哺乳動物，禽類曾有報道糞便中發(fā)現(xiàn)C.muris，但不清楚是否為通過卵囊機械傳播造成的[5]。基于多位點序列分型（MLST），本研究中的鴕鳥源C.muris亞型結(jié)構(gòu)（M5、M4、M6、M4）顯著不同于來自于捷克共和國、肯尼亞、埃及、秘魯、日本和中國的多種人源／動物源C.muris亞型結(jié)構(gòu)，表明鼠隱孢子蟲與宿主存在共進化，其人獸共患性經(jīng)長期宿主適應存在協(xié)同進化[15－16]。

圖4 蒙古沙鼠胃腺中鼠隱孢子蟲各階段蟲體形態(tài)（1 000×）Fig.4 Morphological characterization of C.muris developed in Mongolian gerbils gastric gland（1 000×）

圖5 掃描電鏡觀察Balb／c鼠胃腺寄生的鼠隱孢子蟲（5 000×）Fig.5 C.muris developed in Balb／c mice gastric gland observed by SEM （5 000×）

3.3C.muris動物感染試驗C.muris由Tyzzer于1907年首次在試驗鼠胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名，隨后研究發(fā)現(xiàn)C.muris所有發(fā)育階段均在胃腺完成[17]。日本研究人員先后用家鼠源C.muris分離株（RN66株）進行動物感染試驗，但結(jié)果存在較大差異。1989年，Iseki[18]等報道 RN66株卵囊感染小鼠、貓、豚鼠、兔子和犬，試驗動物個體接種卵囊量均為1.0×106個，卵囊接種3周齡的SPF小鼠后，潛隱期為5 d，顯露期為DPI 34－75，高峰期為DPI 16－26，在高峰期每只小鼠每天排卵囊量達11×106～46×106個，寄生部位為胃腺。1999年，Taylor等[19]等分別用400個、2.0×104個和1.0×106個 RN66株卵囊感染6周齡小鼠，卵囊潛隱期為10～18d，排卵囊持續(xù)至DPI 89，不同劑量感染組小鼠均未表現(xiàn)臨床癥狀，感染組小鼠和不感染對照組體重變化無統(tǒng)計學差異；剖檢可見，胃腺腫大增生，充血，組織學觀察發(fā)現(xiàn)蟲體寄生于胃腺，細胞壞死，粘膜固有層嗜酸性粒細胞浸潤、變形。2001年，Toshihiro等[20]用低劑量RN66株卵囊對3周齡ICR小鼠進行感染試驗，25只小鼠接種24個卵囊，僅1只發(fā)現(xiàn)有卵囊排出，潛隱期為21d；25只小鼠接種240個卵囊，19只感染成功，潛隱期為14～17d；50只小鼠每天接種24個卵囊，連續(xù)接種10d，4只感染成功，潛隱期為14－19d；而5只接種2.4×106個卵囊的小鼠均感染成功，潛隱期為6～7d。上述研究表明，使用同一個C.muris分離株進行動物感染試驗，不同的試驗動物和不同的感染量均可使其感染力、潛隱期及顯露期不同。

不同C.muris分離株存在宿主特異性。自然條件下，野生田鼠可感染C.muris，然而 Modry等[21]用C.muris卵囊人工接種5種田鼠，每只接種1.0×105個卵囊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不感染。同樣，非人靈長類可自然感染C.muris，而近來一個研究發(fā)現(xiàn)，免疫力正常和免疫抑制的食蟹猴接種1.0×107個 RN66株卵囊，均未發(fā)現(xiàn)感染。Kvac等[23－24]人工感染試驗顯示，家鼠源C.muris不能感染8周齡仔豬，但可感染蒙古沙鼠，接種7日齡和8周齡蒙古沙鼠，每只接種1.0×106個卵囊，潛隱期分別為18d和21d，前者顯露期大于90d，排卵囊最大OPG值為12×106，后者顯露期為93～100d，個體每日排卵囊最大OPG值為1.7×106，試驗過程中，均未出現(xiàn)臨床癥狀。Melicherova等[25]用兩種實驗鼠對C.muris進行了生活史研究，分別接種Balb／c鼠和白鼻乳鼠1.0×108個C.muris分離株（TS03株），兩者潛隱期和顯露期存在較大差異，Balb／c鼠潛隱期和顯露期分別為7.5～10d和10～15d，而白鼻乳鼠潛隱期長達18～21d，顯露期呈慢性長期感染。內(nèi)生發(fā)育過程研究顯示，兩種實驗鼠均于接種C.muris卵囊后5d形成厚壁形卵囊，在Balb／c鼠胃內(nèi)薄壁型卵囊和卵囊最早形成于DPI 5和DPI 7.5，而顯著不同的是，在白鼻乳鼠胃內(nèi)薄壁型卵囊和卵囊最早形成于DPI 14和DPI 18，進一步表明不同源C.muris分離株存在宿主差異并與宿主共進化。

本試驗采用鴕鳥源C.muris感染雛雞、Balb／c鼠和蒙古沙鼠，感染量均為1.0×106個卵囊，發(fā)現(xiàn)雛雞不能感染C.muris，Balb／c鼠和蒙古沙鼠均可感染成功。其中Balb／c鼠感染C.muris卵囊后，潛隱期8d，顯露期37d，排卵囊高峰期在DPI 17－DPI 31；蒙古沙鼠的潛隱期為12d，顯露期72d，排卵囊高峰期在DPI 31－DPI 64；兩種實驗鼠的感染差異同Melicherova等[25]的研究，但接種鴕鳥源C.muris分離株的Balb／c鼠顯露期明顯長于接種TS03株的Balb／c鼠，表明鴕鳥源C.muris分離株與TS03株存在不同感染情況。本試驗中感染成功的動物試驗前后精神狀態(tài)良好，無臨床癥狀，組織學和電鏡掃描觀察，僅在胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量C.muris蟲體寄生，并可見其各發(fā)育階段，與前人研究相一致。結(jié)果表明鴕鳥源C.muris與鼠源C.muris感染實驗鼠后在其排卵囊規(guī)律各有差異，臨床表現(xiàn)、寄生部位、內(nèi)生發(fā)育過程相同，存在人獸共患風險，但其如何寄生于鴕鳥及其在鴕鳥體內(nèi)寄生部位和繁殖發(fā)育階段有待進一步研究。

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