邱聰齡,鐘小軍,黃 毅,劉曉宇,蔡澤浪,劉志剛,吉坤美
2.深圳市過敏反應與免疫學重點實驗室,深圳 518060
3.深圳大學第一附屬醫(yī)院,深圳 518060
塵螨(dust mite)是導致過敏性疾病的最重要的室內過敏原,可誘發(fā)I型變態(tài)反應,與過敏性哮喘、過敏性鼻炎及過敏性濕疹等疾病有密切的關系[1]。我國目前有500萬以上的兒童患有過敏性哮喘、5 000萬以上過敏性鼻炎患者和3 000萬以上過敏性皮炎患者,且發(fā)病率和死亡率仍呈上升趨勢[1]。主要致敏的塵螨物種有屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Der p)和粉塵螨(Dermatophagoides farina,Der f),兩者過敏原成分高度同源。我國華南地區(qū)粉塵螨為室內優(yōu)勢致敏螨種[1]。
本課題組采用第2代高通量測序技術解析了粉塵螨基因組和轉錄組,并結合蛋白質組技術首次發(fā)現(xiàn)了粉塵螨新過敏原組分—細胞色素C還原酶結合蛋白(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein,UQCRB)的同源物[2]。這一研究成果被世界衛(wèi)生組織與國際免疫聯(lián)合會下屬的過敏原國際命名委員會正式命名為Der f24。
迄今為止,已經(jīng)從塵螨中分離鑒定并正式命名了24組過敏原組分。其中,塵螨第一組和第二組過敏原(如Der p1、Der p2)是目前公認的最主要的過敏原成分[3];對第一組和第二組塵螨過敏原致敏機制研究也相對清楚,其他成分致敏機制尚不明確;Der p1可通過激活蛋白酶受體、抑制樹突狀細胞分泌IL-12等 途 徑 誘 導 Th2 型 免 疫 反 應[3-4];Der p2作為模擬配體與TLR 4結合而引起Th2型免疫反應[5]。本課題組發(fā)現(xiàn)了第24組塵螨過敏原Der f 24,目前尚無這一生化功能類型的蛋白質作為過敏原的研究報道。本研究主要是克隆表達粉塵螨第24組過敏原cDNA,并對其免疫學特性進行初步的研究。
1.1 材料
1.1.1 主要試劑與材料 粉塵螨cDNA文庫、大腸桿菌菌株E.coliBL21(DE3)plysS、表達載體pET-His由深圳大學過敏反應與免疫學研究所保存。粉塵螨Der f24表位肽由蘇州強耀公司合成。質粒提取試劑、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑、DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、BamH I及HindIII、T4DNA ligase購自大連寶生物公司,蛋白分子量Marker購自Thermo公司,Ni2+-Chelating Sepharose購自GE公司。Biotin偶聯(lián)鼠抗人IgE單抗購自Southern Biotechnology公司。其余試劑均為國產或進口分析純試劑。
1.1.2 血清標本 粉塵螨過敏患者陽性血清32例,男18例,女14例,年齡21~76歲;健康對照血清標本22例,男12例,女10例,年齡22~69歲。血清經(jīng)UniCAP Phadia 100過敏原自動檢測儀檢測,陽性血清對粉塵螨特異性IgE反應達3級或3級以上,陰性血清對粉塵螨特異性IgE反應為0級。血清來自廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,相關臨床實驗獲得該醫(yī)院倫理委員會的批準。
1.2 方法
1.2.1 PCR擴增Der f24cDNA及其克隆與鑒定
以粉塵螨cDNA文庫為模板,根據(jù)GenBank提供的Der f24基因序列數(shù)據(jù)(Accession No.KC669700)設計特異性引物,采用套式PCR技術,上游外引物序列為5′-CTTGTGTATATCACGCTCAG-3′上游內引物序列為 5′-GGATCCATGGTTCATCTTACAAAAACTC-3′,下游外引物序列為5′-CTTGTGTATATCACGCTCAG-3′,下 游 內 引物 序 列 為 5′-AAGCTTTCAATCTTTCGACAAGAAAT-3′。其 中 一 對 內 引 物 分 別 加 入BamHI及HindIII的酶切位點。PCR反應參數(shù)為:94。C預變性5min,94。C30s,55。C30s,72。C30s,最后72。C延伸10min。將擴增產物回收克隆到pMD18-T載體后進行DNA序列分析。
1.2.2 pET-His-Derf24重組表達質粒的構建與原核表達 將Derf24cDNA質粒雙酶切BamH I/HindIII后電泳回收目的基因,克隆至原核表達載體pET-His,構建表達質粒pET-His-Derf24,經(jīng)測序鑒定正確后轉化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)plysS感受態(tài)中,挑選抗氨芐青霉素(Amp)陽性菌落,在200mL LB液體培養(yǎng)基 (0.1mg/mL Amp,0.2%D-Glucose)中,37。C180r/min待細菌生長處于對數(shù)生長期(A600nm約0.6)時,加入終濃度為1mmol/L的IPTG,37。C180rpm誘導蛋白表達。3h后4。C10 000r/min 5min離心收集菌體。以10ml每克濕菌體的比例加入適量緩沖液(pH8.0),充分混勻;加入適量溶菌酶,冰浴攪拌溶解30min。冰浴超聲波破碎細菌:400W,超聲3s,停5s,共20個循環(huán),重復3次。4。C13 000r/min離心20min,收集上清及沉淀小樣SDS-PAGE電泳檢測表達情況。
1.2.3 包涵體的洗滌、變性、純化及復性 將分離的包涵體,以1∶20(w/v)比例加入預冷的包涵體洗滌溶 液 (1.5mol/L Urea,50mmol/L Tris,100 mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA,0.2% (v/v)TritonX-100,pH8.0)充分混勻;4。C,13 000r/min,離心20min,棄上清;沉淀以1:20(w/v)比例加入變性 溶 液 (6mol/L Guanidine Hydrochloride,100 mmol/L Tris,pH8.0),室溫下攪拌溶解3h;4。C,13 000r/min,離心30min;將上清上樣于已平衡Ni2+-Chelating Sepharose層析柱(平衡緩沖液含6 mol/L Urea),待上樣完畢后用緩沖液(含6mol/L Urea)清洗,直至UV檢測(280nm)曲線水平;再用洗 脫 液 (6mol/L Urea,100mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,250mmol/L Imidazole,pH8.0)洗脫目的蛋白,收集目的蛋白。用梯度透析法進行復性,由于該蛋白不含半胱氨酸,無需添加還原劑。
1.2.4 Western blotting檢測rDerf 24與塵螨過敏患者特異性IgE反應性 將上述純化的重組Der f24進行SDS-PAGE電泳,經(jīng)膠濕法轉至NC膜后進行Western blot分析。其中,一抗為粉塵螨過敏患者的血清,同時設健康對照組;二抗為生物素偶聯(lián)的鼠抗人IgE單抗,DAB顯色。其余按照Western blotting常規(guī)方法進行。
1.2.5 Der f 24 3D結構模擬及潛在表位肽的合成利用在線軟件Swiss-Model軟件,參考模板為PDB 1PP9.F,模擬Der f24蛋白的3D結構,并通過DNAStar軟件分析其潛在的B細胞表位,選擇其中3個肽段人工合成,分別為:表位1位于75-88位氨基酸;表位2位于44-57位氨基酸;表位3位于104-117位氨基酸。合成肽N端為Cys,SH基團用于偶聯(lián)到BSA上,合成肽經(jīng)質譜和HPLC分析,由蘇州強耀公司完成。
1.2.6 IgE-ELISA試驗及其統(tǒng)計分析 用碳酸鹽緩沖液(pH9.0)將重組Derf24和合成肽4。C包被過夜;用含5%BSA的PBS溶液37。C封閉2h;按照1∶10的比例稀釋粉塵螨過敏患者血清及陰性對照血清37。C孵育1h;依次加入生物素標記的鼠抗人IgE、鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶37。C孵育,用TMB進行顯色,室溫避光靜置10min后,加入2M硫酸溶液終止反應;在450nm波長處測定吸光度。所有統(tǒng)計學分析,均以特異的IgE的平均數(shù)比較進行。統(tǒng)計學分析采用Wilcoxon rank-sum t分布檢驗進行;P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 粉塵螨Der f cDNA克隆及序列分析 以粉塵螨cDNA文庫為模板,我們先采用1對外引物進行PCR,擴增結果見圖1Lane1所示無明顯條帶,擴增不成功。隨后我們采用內外引物各1套進行套式PCR產物,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,得到1條350bp左右的條帶,大小與理論預計相符(圖1,2)。這說明套式PCR具有更好的特異性??寺『鬁y序結果與已經(jīng)登錄 GenBank(accession No.KC669700)的Derf24基因序列數(shù)據(jù)一致。
圖1 PCR擴增Der f24cDNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product of Der f24cDNA
粉塵螨Der f24cDNA序列從啟起始密碼AUG到終止密碼UGA,共357bp,已登錄Gen-Bank,登錄號為KP064571。具體序列如下:
2.2 pET-His-Der f24重組表達質粒的構建與鑒定 PCR擴增的一對內引物分別添加了BamHI和HindIII位點。通過BamHI和HindIII雙酶切Der f24cDNA基因克隆到pET-His載體上,挑取陽性克隆進行雙酶切鑒定(圖2),并重組質粒進行DNA序列測序確認構建了pET-His-Der f24。
圖2 pET-Der f24重組質粒BamHI/HindIIII雙酶切Fig.2 Electrophoresis of products of pET-His-Derf24double cut by BamHI/HindIII
2.3 Der f24蛋白表達和純化 測序正確的表達質粒 pET-His-Derf24 轉 化E.coliBL21(DE23)plysS,經(jīng)IPTG誘導表達目的蛋白,進行SDSPAGE電泳分析,結果顯示陽性克隆菌株在Mr 14 000左右處有外源蛋白表達條帶出現(xiàn),與預期大小相符;表達產物主要為包涵體,在超聲破碎離心后沉淀里面(如圖3)。重組蛋白經(jīng)變性后溶經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose FF柱層析純化再復性,獲得純的重組Der f24蛋白,濃度為0.48mg/mL,平均每升搖瓶可獲1.8mg純品(如圖3)。
圖3 pET-His-Der f24重組質粒的誘導表達Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant Der f24
2.4 IgE-Weatern Blotting檢測重組Der f24 用粉塵螨過敏患者的血清作為一抗進行IgE-Weatern Blotting實驗,設健康對照陰性組。結果顯示,重組Der f24與10例粉塵螨過敏患者血清特異性IgE(UniCap檢測粉塵螨特異性均在3級以上)呈強陽性反應,不與10例健康對照陰性組血清反應(Uni-Cap檢測粉塵螨特異性IgE均為0級)(圖4)。
圖4 IgE-Western blotting檢測重組Der f24Fig.4 IgE-Western blotting for binding assay of rDer f24
2.5 Der f24 3D結構模擬與表位預測 Der f24與參考模板(template:1PP9.F)氨基酸序列的同源性達56%,利用SWISS-MODEL在線軟件進行同源建模,模擬其3D分子結構,結果見圖5。該分子模型以α螺旋為主,Coil-coli為輔,無β折疊。利用DNASTAR V7.1軟件,預測粉塵螨UQCRB樣蛋白中的B細胞抗原表位,選取三個肽段,分別為表位肽1:75-88位氨基酸肽段(綠色);表位肽2:44-57位氨基酸肽段(紅色);表位肽3:104-117位氨基酸肽段(藍色)見圖5。人工合成時N段添加Cys,SH基團便于與BSA偶聯(lián)(表1)。
2.6 IgE-ELISA測定表位肽與粉塵螨過敏患者血清結合反應 取22份粉塵螨過敏患者血清和22份健康對照陰性血清作為檢測對象,進行3個表位肽IgE-ELISA實驗。統(tǒng)計學方法分析結果顯示,3個表位肽(Peptide 1:75-88aa,Z=5.6734;Peptide 2:44-57aa,Z=5.6720;Peptide 3:104-117aa ,Z=5.6791;3組P<0.0001)均與22份粉塵螨過敏患者血清特異性IgE結合,均不與22例健康對照陰性血清反應。通過與課題組前期報道的重組Der f24 IgE-ELISA結果相比較[2],這3個表位肽與粉塵螨過敏性患者血清特異性IgE結合反應較弱(圖6)。
表1 粉塵螨過敏原Der f24人工合成表位肽Table 1 Synthesis of Der f24epitope peptides
圖5 粉塵螨Der f24 3D模擬結構及其B細胞表位的預測Fig.5 Der f24 3DStructure Modeling and prediction of B-cell epitopes
圖6 IgE-ELISA檢測表位肽與粉塵螨過敏患者特異性IgE反應性Fig.6 IgE-ELISA for binding assay of rDer f24and its epitope peptides
塵螨包括粉塵螨(Dermatophagoidesfarimae)、屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)埋內歐螨(Euroglyphusmaynei)和熱帶無爪螨(Blomiatropicalis)等,它們是室內最主要的吸入性過敏原,其螨體、排泄物和分泌物、死亡后分解物等均含有多種致敏成分,能導致人體產生過敏反應并能引起過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等I型變態(tài)反應性疾病[6]。通過IgE-WB、IgE-ELISA、組胺釋放、皮膚點刺等實驗,從不同種屬的塵螨中先后發(fā)現(xiàn)了30多種不同的致敏組份,可與塵螨過敏患者血清特異的IgE發(fā)生反應,其中已經(jīng)正式命名的塵螨過敏原組份有24組[2]。第1、2、3、9、11、14和15組塵螨過敏原與塵螨過敏患者血清特異的IgE發(fā)生反應反應條帶出現(xiàn)頻次和反應強度均較高,可能是塵螨的主要過敏原成份[7]。粉塵螨基因組和轉錄組研究結果顯示,粉塵螨不含有第12組和第19組過敏原組份。Weghofer M等研究發(fā)現(xiàn),Der p 23主要存在于螨的腸道中,具有結合幾丁質的結構域,可與74%的屋塵螨過敏患者IgE抗體發(fā)生結合,是屋塵螨的主要過敏原之一[8]。
本課題組多組學技術首次發(fā)現(xiàn)了粉塵螨UQCRB同源物與粉塵螨過敏患者血清IgE呈陽性反應,進一步通過人工合成基因表達純化而獲得了重組粉塵螨UQCRB樣蛋白,并對其過敏原性予以初步鑒定,結果顯示其皮膚點刺陽性率為50%(5/10)[2]。這一新發(fā)現(xiàn)的過敏原被正式命名為第24組塵螨過敏原,即Der f 24。本研究克隆了Der f24cDNA基因并表達純化獲得了重組Der f24。通過IgE-WB實驗結果顯示,重組Der f24蛋白與粉塵螨過敏患者特異性IgE抗體結合率高達100%(10/10);另外,IgE-ELISA 顯示其陽性反應值/陰性反應值(P/N值)高(圖5),說明與粉塵螨過敏患者血清特異性IgE抗體的結合能力強。這也說明了Der f24可能是粉塵螨又1個主要的過敏原成份。
本研究基于Der f24的氨基酸序列,利用SWISS-MODEL在線軟件,參考模板 (template:1PP9.F)對粉塵螨UQCRB樣蛋白3D結構進行模擬并預測其B細胞抗原表位,選擇其中3個進行人工合成肽驗證(Epitope 1:75-88aa;Epitope 2:44-57aa;Epitope 3:104-117aa),結果均與與粉塵螨過敏性患者血清特異IgE反應。Der f24表位的初步鑒定為下一步全面鑒定其IgE B細胞表位并明確關鍵氨基酸提供了基礎塵螨過敏原天然提取液中雖然有很多IgE結合蛋白,但大多不穩(wěn)定,可被內源性蛋白酶降解,且單一過敏原組份由于含量低,很難通過這種天然提取液純化而大量獲取。重組過敏原純度高、易標準化,在臨床診斷和治療中,相比塵螨浸液提取物有一定的優(yōu)勢[9]。本研究通過原核表達純化獲得了大量高純度重組Der f24蛋白,且具有很強的結合特異性IgE活性。在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百種過敏蛋白中,沒有報道過具有這一類生化功能的蛋白可以作為過敏原。這為研究過敏反應發(fā)生的機制提供了新的線索。本研究為螨性過敏性疾病的發(fā)生機制及其診斷和治療奠定新的技術基礎。
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