李亞男, 車曉倩, 王宏偉, 李 茹, 孫慧斌

(山東 青島 266100: 1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院東區(qū)口腔科; 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院東區(qū)檢驗(yàn)科;3.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所公共實(shí)驗(yàn)室)

機(jī)械預(yù)備與半導(dǎo)體激光對糞腸球菌殺菌作用的體外研究

李亞男1, 車曉倩1, 王宏偉2, 李 茹3, 孫慧斌1

(山東 青島 266100: 1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院東區(qū)口腔科; 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院東區(qū)檢驗(yàn)科;3.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所公共實(shí)驗(yàn)室)

目的: 評價(jià)半導(dǎo)體激光對感染根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌效果。方法：成功建立糞腸球菌感染人單根管恒牙模型50個(gè)， 用ProTaper F3銼預(yù)備根管后隨機(jī)分為5組(n=10)，A組: 空白對照，不照射激光；另4組分別用不同功率、時(shí)間半導(dǎo)體激光照射根管內(nèi)壁, B組：1.0 W，10 s；C組：1.0 W，20 s；D組：2.0 W，10 s；E組：2.0 W，20 s。各組標(biāo)本均于處理前、后在根管內(nèi)壁表面取樣并進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)；然后再分別用F4、F5銼依次預(yù)備并收集兩種深度的牙本質(zhì)碎屑，經(jīng)厭氧培養(yǎng)后采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果：①各組處理后的根管內(nèi)壁細(xì)菌量均較處理前下降(P<0.05)，各激光組細(xì)菌清除率均高于對照組(P<0.05)，而各激光組之間兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); ②各激光組均能使兩種深度牙本質(zhì)中的細(xì)菌量明顯減少(P<0.05)；其中照射10 s 時(shí), 2.0 W比1.0 W的殺菌效果好(P<0.05)，而照射20 s時(shí), 不同功率的殺菌效果無顯著差異(P>0.05)；用1.0 W時(shí)，照射20 s比10 s的殺菌效果好(P<0.05)，而用2.0 W時(shí)，照射10、20 s的殺菌效果無差異(P>0.05)。結(jié)論：半導(dǎo)體激光對根管內(nèi)壁及深層牙本質(zhì)的糞腸球菌均有殺菌作用，其對牙本質(zhì)深層的殺菌效果隨著照射時(shí)間延長、功率增大而增強(qiáng)。

糞腸球菌; 半導(dǎo)體激光; 根管治療; 殺菌率

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.006

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):483]

根管治療術(shù)是治療牙髓病和根尖周病的有效方法，但即使經(jīng)過完善的根管治療，患牙仍存在4%～15%的失敗率[1]，特別是行根管再治療的患牙，其失敗率更高[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在難治性和繼發(fā)性感染的根管中，糞腸球菌是最常分離到的細(xì)菌種類，其檢出率可達(dá)77%[3]，是目前評價(jià)各種感染清除措施時(shí)最常用的目標(biāo)菌種。

另有研究表明，糞腸球菌主要以生物膜的形式穩(wěn)定存在于患牙的根管中[4-5]，并能進(jìn)入牙本質(zhì)小管不斷釋放致病因子，是根管治療失敗的主要原因。由于根管系統(tǒng)的復(fù)雜性，傳統(tǒng)的機(jī)械預(yù)備及化學(xué)消毒均無法徹底清除根管內(nèi)的糞腸球菌。因此，尋找一種即安全，又能有效殺滅根管內(nèi)細(xì)菌(特別是糞腸球菌)的滅菌方法，對提高根管治療術(shù)的效果尤為重要。

近年來，關(guān)于激光對糞腸球菌的殺菌作用已成為研究熱點(diǎn)，激光產(chǎn)生的瞬時(shí)高溫足以殺滅根管內(nèi)的細(xì)菌，并能清除細(xì)菌內(nèi)毒素等代謝產(chǎn)物，尤其對側(cè)支根管和彎曲根管也有滅菌作用。鑒于半導(dǎo)體二極管激光970 μm的波長所產(chǎn)生的能量能充分被軟組織內(nèi)的水、血紅蛋白及黑色素所吸收，適合應(yīng)用于口腔治療。本實(shí)驗(yàn)通過建立穩(wěn)定的糞腸球菌感染根管模型，評價(jià)半導(dǎo)體二極管激光處理對根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌效果，以期為臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉(ATCC29212，美國)；機(jī)用ProTaper鎳鈦銼(登士柏，美國)；激光治療儀(西諾德，德國) ；掃描電鏡(S- 4800，Hitachi，日本)； CO2培養(yǎng)箱(DY- 2，浙江義烏冷凍機(jī)總廠)；CrystalspecTM比濁儀(Becton Dickinson, 美國)。

1.2 標(biāo)本制備

1.2.1離體牙的選擇和預(yù)處理

臨床收集新鮮拔除的人單根管恒牙54個(gè)(均根尖孔發(fā)育完全、未行根管治療、 無根裂等)，置于52.5 g/L NaClO中浸泡消毒24 h后，用慢速切鋸截去牙冠，并分別截取其10 mm長的牙根。用ProTaper鎳鈦銼將各牙根的根管逐步擴(kuò)大到F3(ISO標(biāo)準(zhǔn))后，170 g/L EDTA 和10 g/L NaCIO交替超聲震蕩清洗根管，以去除玷污層。預(yù)備完成的所有樣本經(jīng)高溫高壓滅菌后，隨機(jī)抽取2個(gè)樣本，用1 mL無菌PBS溶液沖洗根管，并收集沖洗液進(jìn)行接種培養(yǎng)；確定無細(xì)菌生長后用于感染根管模型的建立。

1.2.2 感染根管模型的建立

本實(shí)驗(yàn)感染根管模型建立參照郭惠杰等[6]報(bào)道的方法：將糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株凍干粉常規(guī)復(fù)蘇后劃線接種于腦-心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)皿，置于37 ℃、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后，挑取數(shù)個(gè)單菌落轉(zhuǎn)至1 mL BHI液體培養(yǎng)基中，增菌培養(yǎng)48 h。然后取20 μL菌懸液分別注入上述各根管后，將牙根放入含1 mL BHI液體培養(yǎng)基的無菌EP管中(每管1個(gè))，并置于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)；每3 d更換1次菌懸液，連續(xù)培養(yǎng)4周。培養(yǎng)結(jié)束后隨機(jī)抽取2個(gè)樣本，分別沿頰舌向劈開并放入25 mL/L戊二醛中固定48 h后，依次放入300、500、700、800、900、1 000 mL/L乙醇中各15 min 進(jìn)行逐級脫水；然后常規(guī)干燥、噴金，用掃描電鏡(×5 000～10 000)對各樣本的根管內(nèi)壁進(jìn)行觀察。確認(rèn)根管內(nèi)壁及牙本質(zhì)小管中糞腸球菌生長(模型建立成功)后用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理

將上述50個(gè)成功建立感染根管模型的樣本隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5組(n=10)，其中A組用ProTaper F3銼再次預(yù)備，作為空白對照組；其余4組按以下方法進(jìn)行激光處理，B組: 1.0 W激光照射2次; C組: 1.0 W激光照射4次; D組: 2.0 W激光照射2次; E組: 2.0 W激光照射4次；每次照射5 s，間隔5 s。各激光照射組在每次照射時(shí)先將光纖置于根尖孔上方0.5～1 mm處，然后以S形的走向從下往上提拉并逐步退出，不要長時(shí)間指向某一點(diǎn)。

1.4 殺菌效果的觀察

1.4.1 感染根管內(nèi)壁細(xì)菌量的評估

分別于單純機(jī)械預(yù)備(對照組)和激光處理(實(shí)驗(yàn)組)前、后取各組感染根管樣本，用#30無菌紙尖干燥根管，分別在各根管內(nèi)注入PBS緩沖液，并將#30無菌紙尖插入根管至根尖孔處(保持紙尖與根管壁相接觸)；停留1 min后取出紙尖并立即放入裝有PBS溶液的EP管中，用小型振蕩器振蕩1 min；然后從每個(gè)EP管中各吸取5 μL液體，10倍系列稀釋后接種培養(yǎng)48 h，分別計(jì)算各組的菌落數(shù)和細(xì)菌清除率。

1.4.2 牙本質(zhì)小管內(nèi)殺菌效果的評估

取上述處理取樣后的根管標(biāo)本，分別用ProTaper F4、F5銼收集2個(gè)不同深度的牙本質(zhì)碎屑(牙本質(zhì)壁下100、200 μm)；然后將碎屑轉(zhuǎn)至裝有BHI液體培養(yǎng)基的EP管中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，并于培養(yǎng)24 h后采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌感染根管模型的建立

根管樣本經(jīng)滅菌后抽樣檢查發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)皿上均未見細(xì)菌生長。根管內(nèi)注入糞腸球菌菌懸液培養(yǎng)4周后，隨機(jī)抽取2個(gè)樣本用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，根管內(nèi)壁有糞腸球菌生物膜形成(圖1)，并可見糞腸球菌侵入牙本質(zhì)小管內(nèi)定植生長(圖2)；提示糞腸球菌感染根管模型建立成功。

圖2 糞腸球菌定植于牙本質(zhì)小管(SEM, ×10 000)

2.2 機(jī)械預(yù)備和激光對感染根管內(nèi)壁細(xì)菌的清除作用

處理前各組感染根管內(nèi)壁的原始細(xì)菌量相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)機(jī)械處理(對照組)和激光處理后(實(shí)驗(yàn)組)，各組的細(xì)菌量均較其處理前顯著下降(P<0.05)，其中A組的細(xì)菌清除率為39.45%， B、C、D、E組的細(xì)菌清除率分別為92.01%、93.18%、92.64%、92.94%；各激光組分別與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，而各激光組之間兩兩相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。提示機(jī)械預(yù)備和激光處理對根管內(nèi)壁的糞腸球菌均有清除作用，且激光的除菌效果更好，但不同能量不同時(shí)間激光照射對根管內(nèi)壁表面的殺菌效果無差異。

表1 各組根管內(nèi)壁糞腸球菌菌落數(shù)的比較

*與同組內(nèi)處理前相比P<0.05；不同字母組間兩兩相比P<0.05

2.3 機(jī)械預(yù)備和激光對牙本質(zhì)小管內(nèi)細(xì)菌的清除作用

各組兩種深度部位的牙本質(zhì)碎屑經(jīng)厭氧培養(yǎng)后，麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行菌落計(jì)數(shù)顯示：與對照組相比，不同功率的激光照射不同時(shí)間后，均能使兩種深度牙本質(zhì)中的糞腸球菌量明顯減少(P<0.05)；其中照射10 s時(shí), 2.0 W比1.0 W的殺菌效果好(P<0.05)，而照射20 s時(shí), 不同功率的殺菌效果無差異(P>0.05)；用1.0 W時(shí)，照射20 s比10 s的殺菌效果好(P<0.05)，而用2.0 W時(shí)，照射10、20 s的殺菌效果無差異(P>0.05)(表2)。以上結(jié)果提示，半導(dǎo)體激光有一定的穿透能力，能殺滅侵入牙本質(zhì)小管內(nèi)的細(xì)菌，其殺菌效果在一定范圍內(nèi)隨著時(shí)間延長、功率增大而增強(qiáng)。

表2 各組感染牙本質(zhì)小管內(nèi)糞 腸球菌菌落數(shù)比較

組間相比不同字母P<0.05; MCF為比濁麥?zhǔn)蠞舛葐挝?/p>

3 討論

根管系統(tǒng)的復(fù)雜性決定了根管消毒的重要性，細(xì)菌感染是造成根管治療失敗的主要原因。糞腸球菌作為根管治療后可能分離到的最多的細(xì)菌[7-8]，其存在與再治療根管的臨床癥狀或體征密切相關(guān)[9]。糞腸球菌是G+兼性厭氧菌，可侵入到牙本質(zhì)小管深層，同時(shí)還能在根尖部通過形成生物膜[10]而抵制抗菌劑的作用、增強(qiáng)細(xì)菌的致病能力及耐藥性[11],并使其在寡能量、低體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉及弱堿性環(huán)境下均能生長[12]。因此，糞腸球菌可以在常規(guī)沖洗劑及診間氫氧化鈣封藥中存活下來，從而造成頑固性或繼發(fā)性根管內(nèi)感染。

常規(guī)機(jī)械根管預(yù)備完成后，根管內(nèi)的壞死牙髓組織和根管內(nèi)壁附著的感染物已被大部分去除，但牙本質(zhì)小管深層和根管側(cè)支等器械和沖洗液達(dá)不到的部位仍有殘余的細(xì)菌、毒素存在。有研究發(fā)現(xiàn)，通過機(jī)械的方法預(yù)備后雖可使根管內(nèi)的糞腸球菌總量減少，但不能完全去除，而且不同的預(yù)備技術(shù)和不同器械清除細(xì)菌的能力無顯著性差異[13]。所有器械均不能完全去除根管內(nèi)碎屑和玷污層，尤其是根尖1/3[14]。因此，近年來我們將激光照射引入根管消毒中，以期減少糞腸球菌的數(shù)量，提高根管治療的成功率。

目前，激光已廣泛應(yīng)用于口腔軟組織外科手術(shù)、黏膜病及牙周抗炎治療、牙體牙髓治療等各個(gè)領(lǐng)域。激光輔助牙體牙髓治療主要包括齲病的預(yù)防、診斷，去齲備洞，根管治療，牙漂白及牙本質(zhì)過敏等。激光照射產(chǎn)生的瞬時(shí)高溫能氣化根管壁殘存的碎屑和玷污層，并可通過熔融和封閉牙本質(zhì)小管而降低牙本質(zhì)通透性；從而有利于根充材料更緊密接觸根管壁，使根管充填更完善、降低根尖滲漏的發(fā)生率，防止炎癥復(fù)發(fā)。另外，激光還能改善尖周組織的血液循環(huán)，減輕炎癥的滲出速度及程度，并使局部組織中的5-羥色胺含量減少，有明顯的消炎止痛作用。

本實(shí)驗(yàn)在建立糞腸球菌感染根管模型的基礎(chǔ)上，觀察不同功率的半導(dǎo)體激光照射不同時(shí)間后，對根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果，并與單純機(jī)械預(yù)備的根管作對比。結(jié)果顯示，機(jī)械預(yù)備和激光處理均可使根管內(nèi)壁的糞腸球菌量明顯下降，各激光照射組與單純機(jī)械預(yù)備相比殺菌效果更為顯著; 進(jìn)一步證實(shí)了單純機(jī)械預(yù)備不能完全清除根管內(nèi)感染，和其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[15-17]。但各激光組之間相比，無論是增大激光功率，還是延長激光照射時(shí)間，均不能顯著提高其對根管內(nèi)壁表面糞腸球菌的殺菌率。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌可侵入牙本質(zhì)小管深層定植生長，故采用F4、F5鎳鈦銼收集不同深度的牙本質(zhì)碎屑，以觀察各組對不同深度牙本質(zhì)小管中糞腸球的清除效果?？紤]鎳鈦銼錐度的可變性，認(rèn)為收集的碎屑大致來自根管壁牙本質(zhì)100、200 μm的深度。兩種深度牙本質(zhì)碎屑內(nèi)的糞腸球菌量均較對照組明顯減少，說明激光能穿透牙本質(zhì)而起殺菌作用，并且與時(shí)間、功率呈正相關(guān)；但當(dāng)時(shí)間或功率超過一定程度后，其中一種因素的變化將不能顯著提高殺菌效果。本實(shí)驗(yàn)中時(shí)間和功率最大值組(20 s，2.0 W)也不能完全殺滅牙本質(zhì)小管深層的細(xì)菌，且殺菌效果不如根管內(nèi)壁理想，這可能與激光產(chǎn)生的瞬時(shí)高熱使牙本質(zhì)熔融后封閉了牙本質(zhì)小管，從而導(dǎo)致牙本質(zhì)通透性降低有關(guān)。

綜上所述，半導(dǎo)體激光能夠有效殺滅感染根管內(nèi)壁、牙本質(zhì)小管內(nèi)的糞腸球菌，且操作簡便、高效。雖然隨著激光功率的增大、照射時(shí)間的延長對牙本質(zhì)深層的殺菌效果更好，但其瞬時(shí)產(chǎn)生的能量也越大，有可能對根尖周組織產(chǎn)生熱損傷；故建議臨床上應(yīng)在達(dá)到殺菌效果的基礎(chǔ)上選取較小功率的激光進(jìn)行多次照射。

[1]Smith CS，Setchell DJ，Harty FJ．Factors influencing the success of conventional root canal therapy- a five- year retrospective study [J].IntEndodJ，1993，26 (6)：321-333.

[2]Sundqvist G，F(xiàn)igdor D，Persson S，etal．Microbiologic analysis of teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative retreatment [J].OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod，1998，85(1)：86-93.

[3]Siqueira IF Jr，R?as IN. Polymerase chain reaction- based analysis of microorganisms associated with failed endodontic treatment [J]．OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod, 2004,97(1):85-94.

[4]Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ. Biofilm formation in medicated root canals [J].JEndod, 2002,28(10):689-693.

[5]Nair PN，Henry S，Cano V，etal．Microbial status of apical root canal system of human mandibular first molars with primary apical periodontitis after“one- visit”endodontic treatment [J]．OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod, 2005,99(2):23l-252.

[6]郭惠杰，岳林. 糞腸球菌在根管內(nèi)定植模式的體外研究 [J]. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，41(6)：699-701.

[7]Nair PN．On the causes of persistent apical periodontitis：a review [J]．IntEndodJ，2006，39(4)：249-281.

[8]Stuart CH，Schwartz SA，Beeson TJ，etal. Enterococcus faecalis:its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment [J]．JEndod，2006，32(2)：93-98.[9]牛衛(wèi)東, 宋其義, 王麗娜, 等. 再治療根管內(nèi)糞腸球菌檢出及其與臨床表征關(guān)系的分析研究 [J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，29(5)：535-538.

[10]Peters LB，Wesselink PR，Buijs JF，etal．Viable bacteria in root dentinal tubules of teeth with apical periodontitis [J].JEndod，2001，27( 2)：76-81.

[11]Guerreiro- Tanomaru JM，de Faria- Junior MB，Duarte MA，etal. Comparative analysis of Enterococcus faecalis biofilm formation on different substrates [J].JEndod，2013，39(3)：346-350.

[12]冉淑君，鄂佳，朱彩蓮，等. 不同理化條件對糞腸球菌生長周期及生物膜形成能力的影響 [J]. 中華口腔醫(yī)學(xué)雜志社，2013，48(9)：529-534.

[13]Matos Nero M，Santos SS，Leao MV,etal．Effectiveness of three instrumentation systems to remove Enterocoeeus faecalis from root canals [J]．IntEndodJ，2012，45(5)：435-438.

[14]郭曉琳，彭偉，魯麗珍，等.臨床常用根管預(yù)備器械清潔能力的掃描電鏡觀察 [J]. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2013，23(9)：595-598，601.

[15]Pataky L，lvanyi I，Grigar A，etal．Antimicrobial efficacy of various root canal preparation techniques：An in vitro comparative study [J]．JEndod，2002，28(8)：603-605.

[16]Dalton BC，Orstavik D，Phillips C，etal．Bacterial reduction with nickel titanium rotary instrumentation [J]．JEndod，1998，24(11)：763-767.

[17]Coldero LG，Mcttugh S，MacKenzie D，etal．Reduction in intracanal bacteria during root canal preparation with and without apical enlargement [J]．IntEndodJ，2002，35(5)：437-446.

Antibacterial efficacy of mechanical preparation and diode laser onenterococcusfaecalisin vitro

LI Ya- nan*, CHE Xiao- qian, WANG Hong- wei, LI Ru, SUN Hui- bin

(*DepartmentofStomatology,AffiliatedhospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266100,China)

AIM: To evaluate the antibacterial efficacy of mechanical preparation and diode laser onenterococcusfaecalisin infected root canals in vitro. METHODS: 50 single-rooted teeth of in vitro root canalenterococcusfaecalisinfection model were randomly divided into 5 groups (n=10). The root canals of the teeth in the control group were prepared by Protaper F3. After F3 preparation, the tooth canals in the other 4 groups were treated with diode laser for 10 s and 20 s with 1.0 W or 2.0 W, respectively. Microbiological samples were collected from the root canals before and after irrigation. The dentin debris from two depths of the root canals were collected and cultured for turbidimetric count. A one- way ANOVA with the Tukey Test was conducted for the comparisons among the groups. RESULTS: The numbers ofE.faecalisin all the groups decreased after treatment (P<0.05). The bacterieidal ration (BR) of the treatment groups was higher than that of the control(P<0.05). Between each 2 laser groups,P>0.05. The number ofE.faecalisfrom two different depths of dentin reduced in all the laser groups(P<0.05). Under the condition of 10 s jrradiation, the disinfection was more effective with 2.0 W than that with 1.0 W, and there was no significant difference between 10 s irradiation and 20 s irradiation under the conditions of 2.0 W irradiation. With 1.0 W the disinfection was more effective by 20 s irradiation than by 10 s, and with 2.0 W there was no significant difference between 10 s and 20 s irradiation. CONCLUSION: Diode laser is effective on root canal disinfection due to its effective penetration in dentins. The bactericidal effect enhances with increase of irradiation time and energy.

enterococcus faecalis; diode laser; root canal treatment; bactericidal ratio

2015-02-05

青島大學(xué)附屬醫(yī)院青年科研基金

李亞男(1988-)，女，漢族，山東濟(jì)南人。碩士生(導(dǎo)師：孫慧斌)

孫慧斌，E-mail：shb353.qindao@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0483-05