劉靜波, 李 琛, 郭 艷, 張冬梅, 趙海礁, 潘亞萍

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所: * 牙周科, ** 中心實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng) 110002)

熱滅活牙齦卟啉單胞菌對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響

劉靜波*, 李 琛*, 郭 艷**, 張冬梅*, 趙海礁*, 潘亞萍*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所:*牙周科,**中心實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng) 110002)

目前: 探討熱滅活牙齦卟啉單胞菌(Pg)對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞(HMSCs)增殖和成骨分化的影響。方法：①將常規(guī)培養(yǎng)24 h后的HMSCs隨機(jī)分為2組, 實(shí)驗(yàn)組加入熱滅活Pg，對(duì)照組加入等量無菌PBS, 共同培養(yǎng)24 h后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8檢測(cè)兩組細(xì)胞的增殖活性; ②將常規(guī)培養(yǎng)24 h后的HMSCs隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)組加入熱滅活Pg，對(duì)照組和基線組加入等量無菌PBS繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)，取基線組細(xì)胞直接用于ALP活性及成骨相關(guān)基因的PCR檢測(cè)；而實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組則再進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，采用RT-PCR法檢測(cè)其RUNX- 2、ALP mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：熱滅活Pg與HMSCs共同培養(yǎng)24 h后，其細(xì)胞的增殖雖明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，但其細(xì)胞形態(tài)則與對(duì)照組基本一致；成骨誘導(dǎo)14 d后, 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的ALP活性和成骨相關(guān)基因RUNX- 2、ALP mRNA的表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，高于基線組(P<0.05)。 結(jié)論：HMSCs在熱滅活Pg刺激下增殖和成骨能力明顯降低。

牙齦卟啉單胞菌(Pg); 成骨分化; 細(xì)胞增殖; 成骨分化

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.12.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(12): 709]

牙周炎是發(fā)生于牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，是我國(guó)成年人失牙的主要原因之一，且與多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[1]。當(dāng)牙周組織因炎癥被破壞后，其結(jié)構(gòu)和功能的重建一直是牙周病學(xué)研究領(lǐng)域中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是與牙周炎密切相關(guān)的紅色復(fù)合體中的重要成員，被認(rèn)為是毒力最強(qiáng)的牙周致病菌之一。本課題組前期研究表明，牙周基礎(chǔ)治療后6周時(shí)，在牙周炎患者的炎癥得到控制的齦溝內(nèi)有Pg開始重新定植[2]。由于這一時(shí)期正是牙周組織再生的關(guān)鍵期，因此也說明Pg對(duì)牙周組織再生的影響不容忽視。本實(shí)驗(yàn)擬采用熱滅活Pg刺激人間充質(zhì)干細(xì)胞(HMSCs)，并觀察其對(duì)HMSCs增殖和成骨分化的影響，以期為研究牙周炎患者牙周組織再生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 熱滅活Pg菌懸液的制備

首先將PgATCC 33277菌株(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔生物學(xué)教研室保存)接種于BHI固體培養(yǎng)基(添加氯化血紅素、維生素K和無菌脫纖維羊血)，置于37 ℃厭氧條件(800 mL/L N2、100 mL/L H2、100 mL/L CO2)下培養(yǎng)7 d后，再轉(zhuǎn)種于BHI液體培養(yǎng)基繼續(xù)厭氧培養(yǎng)過夜；然后離心(9 000 r/min)10 min并收集細(xì)菌，以新鮮配置的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次并重懸后，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后的Pg菌懸液經(jīng)70 ℃孵育1 h，并用0.22 mm無菌濾器過濾[3]后，從中取10 mL接種于BHI固體培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng)(條件同上)；連續(xù)培養(yǎng)5 d，并確定無菌落形成后，即可將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 HMSCs的培養(yǎng)和傳代

取脂肪來源的HMSCs(Lifeline，美國(guó))接種于專用間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液 (StemLife LL-0034)(Lifeline，美國(guó))中，并置于37 °C、50 mL/L CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。隔日換液1次，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)，進(jìn)行傳代。取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 滅活Pg對(duì)HMSCs增殖影響的觀察

取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMSCs，用25 g/L的胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))消化后，以1 000 /孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，并于每孔中各加入100 μL專用間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，置于37 ℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為2組: 實(shí)驗(yàn)組按照細(xì)菌 ∶細(xì)胞=100 ∶1的比例加入熱滅活的Pg菌懸液[4]; 對(duì)照組加入等體積的無菌PBS。兩組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡(上海研潤(rùn)光機(jī))觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；然后分別取各組細(xì)胞按照細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(大連美侖生物)的操作說明，于每孔中各加入10 μL細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑并繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀(SmartSpec 300)(Biochrom，日本)分別測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD值)。

1.4 滅活Pg對(duì)HMSCs成骨分化影響的觀察

1.4.1 分組處理和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)

取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMSCs以10 000 /孔的細(xì)胞密度接種于24孔板， 每孔中各加入1 mL專用間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，置于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和基線組， 實(shí)驗(yàn)組按照細(xì)菌 ∶細(xì)胞=100 ∶1比例加入Pg熱滅活菌懸液；對(duì)照組和基線組加入等體積無菌PBS繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖達(dá)90%匯合時(shí)，收集基線組細(xì)胞直接用于ALP和成骨相關(guān)基因的檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞用無菌PBS洗滌2次后再加入新鮮配置的成骨誘導(dǎo)液[5](含50 μg/mL 維生素C、 10 mmol/L β-甘油磷酸酯的間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d 換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)至14 d后用于ALP和成骨相關(guān)基因檢測(cè)。

1.4.2 ALP檢測(cè)

分別取上述各組細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后加入顯色底物和檢測(cè)緩沖液，并置于37 ℃條件下孵育30 min，然后用酶標(biāo)儀分別測(cè)定其405 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD值)。以上所有操作均嚴(yán)格按照ALP檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)說明書。

1.4.3 成骨相關(guān)基因表達(dá)的PCR檢測(cè)

分別取上述各組細(xì)胞用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，并用高性能反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life technologies，美國(guó))合成cDNA；然后以cDNA為模板，以GAPH作為內(nèi)參照，用ABI7700real-time PCR儀和SYBR GREEN試劑盒(Qiagen，美國(guó))分別對(duì)RUNX-2、ALP基因進(jìn)行RT-PCR分析。所用引物由寶生物公司合成，具體引物序列參照文獻(xiàn)[6]。PCR反應(yīng)體系共20 μL，分別為：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA模板2.0 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、dH2O 6.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s后，95 ℃、5 s，58 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各基因的mRNA相對(duì)濃度。試驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 熱滅活Pg對(duì)HMSCs增殖的影響

HMSCs與熱滅活Pg共同培養(yǎng)24 h后，倒置相差顯微鏡觀察，其細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組基本一致，呈多角形，且貼壁生長(zhǎng)；但其細(xì)胞匯合度則低于對(duì)照組(圖1)。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖情況(OD值)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖2)。

實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組

*與對(duì)照組相比P < 0.05

2.2 熱滅活Pg對(duì)HMSCs成骨分化的影響

2.2.1 熱滅活Pg對(duì)ALP活性的影響

ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組(熱滅活Pg刺激后的HMSCs)和對(duì)照組(未經(jīng)熱滅活Pg刺激的HMSCs)細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)14 d后，兩組細(xì)胞中的ALP活性均較基線組(未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的HMSCs)明顯升高(P<0 .05 )；其中以對(duì)照組的ALP活性升高最明顯，與實(shí)驗(yàn)組相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

*與基線組相比P<0.05；#與實(shí)驗(yàn)組相比P<0.05

2.2.2 熱滅活Pg對(duì)RUNX-2和ALP基因表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組(熱滅活Pg刺激的HMSCs)和對(duì)照組(未經(jīng)熱滅活Pg刺激的HMSCs)細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)14 d后， 兩組細(xì)胞中的RUNX-2和ALP基因表達(dá)水平均較基線組(未經(jīng)熱滅活Pg刺激和成骨誘導(dǎo)的HMSCs)明顯升高(P<0.05 )；其中對(duì)照組升高最明顯，兩種基因的表達(dá)水平均明顯高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05 )(圖4)。

*與基線組相比P<0.05；#與實(shí)驗(yàn)組相比P<0.05

3 討論

牙周炎是以牙周組織破壞為特征的感染性疾病，當(dāng)牙周組織因炎癥被破壞后，重建牙周組織的正常生理結(jié)構(gòu)和功能一直是牙周治療追求的最終目標(biāo)。Pg是目前公認(rèn)的牙周致病菌之一，可產(chǎn)生多種毒力因子和蛋白，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。牙周基礎(chǔ)治療是減少或清除Pg的定植，但在治療后短期內(nèi)Pg又會(huì)在齦下區(qū)域重新定植[2, 7]。此時(shí)，牙周組織的再生不可避免的會(huì)受到齦下微環(huán)境中細(xì)菌(尤其是Pg)的影響。因此，本研究通過構(gòu)建熱滅活Pg(熱滅活Pg能夠保留大部分的細(xì)菌功能蛋白)刺激HMSCs模型來模擬機(jī)體齦下炎癥微環(huán)境，以探討Pg蛋白對(duì)HMSCs增殖和成骨分化的影響，以期為牙周炎患者牙周組織再生的研究提供參考。

以往研究表明，HMSCs能夠重建包括牙周韌帶、牙骨質(zhì)、牙槽骨在內(nèi)的全部牙周組織，已成為牙周組織再生可以選擇的細(xì)胞源之一，從而為重建牙周組織的正常結(jié)構(gòu)創(chuàng)造了便利條件[8-9]。目前國(guó)內(nèi)外研究主要使用牙周膜細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為牙周再生的種子細(xì)胞。本研究選用的脂肪來源的HMSCs與上述兩種細(xì)胞相比，獲取更加方便，且對(duì)供體創(chuàng)傷較小，具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。

Krebirel等通過構(gòu)建Pg和HMSCs共培養(yǎng)模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)72 h后仍有40%的細(xì)胞存活，其細(xì)胞因子IL-8的分泌水平較低[10]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，熱滅活Pg與HMSCs共同培養(yǎng)24 h后，雖能明顯抑制HMSCs的增殖，但仍有大量細(xì)胞存活，其形態(tài)與對(duì)照組相比亦無明顯差異，僅細(xì)胞匯合度有所下降。該結(jié)果提示，部分HMSCs在Pg刺激條件下仍能夠存活并增殖，與Krebirel等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

ALP是成骨細(xì)胞及干細(xì)胞成骨分化時(shí)的一種細(xì)胞表面標(biāo)志性酶，其表達(dá)水平會(huì)隨著細(xì)胞成骨分化程度的增加而增強(qiáng)；RUNX-2是參與調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，兩者均為骨骼形成和發(fā)育的關(guān)鍵性標(biāo)志基因。有研究發(fā)現(xiàn)，Pg脂多糖與牙周膜細(xì)胞共同培養(yǎng)后，能夠顯著抑制牙周膜細(xì)胞的ALP活性，及其膠原蛋白1和骨鈣素的產(chǎn)生[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)熱滅活Pg刺激的HMSCs再進(jìn)行成骨誘導(dǎo)14 d后，與未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的基線組相比，其細(xì)胞中的RUNX-2和ALP基因表達(dá)水平均明顯上調(diào)；但與對(duì)照組相比，兩基因的表達(dá)水平均明顯降低。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)14 d時(shí)的ALP活性檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果的變化趨勢(shì)一致。以上結(jié)果提示，HMSCs在Pg蛋白的刺激下仍能進(jìn)行成骨分化，但與未經(jīng)Pg蛋白刺激HMSCs相比，其成骨能力顯著降低。

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The effect of heat-inactivatedPorphyromonasgingivalison the proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells

LIU Jing- bo*, LI Chen, GUO Yan, ZHANG Dong- mei, ZHAO Hai- jiao, PAN Ya- ping

(*DepartmentofPeriodontology,SchoolofStomatology，ChinaMedicalUniversity，LiaoningInstituteofDentalResearch，Shenyang110002，China)

AIM: To investigate the effect of heat-inactivatedPorphyromonasgingivalis(HIPg) on the proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (HMSCs). METHODS: Cultured HMSCs were co- incubated with HIPgand PBS respectively for 24 h, then the cell proliferation was examined by a cell counter kit- 8. HMSCs were cultured with HIPgsupernatant (base line group) and sterile PBS(control group) until the cells reached 90% confluence. The cells in baseline group were collected, and the cells in treatment group and control group were incubated in osteogenic medium for 14 days. Then cells were harvested, alkaline phosphatase (ALP) activity was examined by ALP- kit and the mRNA level of ALP and RUNX- 2 was tested by RT- PCR. RESULTS: Heat- inactivatedPgreduced the proliferation of HMSCs (P<0.05) and ALP activity (P<0.05), decreased the mRNA level of RUNX- 2 (P<0.05) and ALP (P<0.05). CONCLUSION: Heat- inactivatedPgmay inhibit the proliferation and osteogenic differentiation of HMSCs.

Porphyromonasgingivalis(pg); osteogenic differentiation; cell proliferation; osteogenic differentiation

2015-07-03；

2015-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(81200785)

劉靜波(1980-)，女，漢族，遼寧沈陽(yáng)人。博士，講師，主治醫(yī)師

潘亞萍，E-mail：yap_nancy@yahoo.comm

R780.2

A

1005-2593(2015)12-0709-04

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目基金(L2013311)

遼寧省自然科學(xué)基金(2013021030)