河北中醫(yī)學院 (石家莊050200)

張一昕 鄧國興 吳中秋 于文濤 徐 晶 韓 雪 潘思彤

研究表明，肝X 受體(LXRs)對膽固醇的吸收、輸出、轉運和分泌等諸多過程具有調(diào)控作用，LXRs 信號通路在非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用，并有望成為治療NAFLD 的重要靶點。［1］ATP 結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)是LXRs 的靶基因，是一種重要的膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白。［2］前期臨床研究表明，消痰化瘀中藥具有良好的調(diào)節(jié)血脂和治療NAFLD 作用。［3］為了進一步探討其作用機制，筆者觀察了消痰化瘀中藥對模型大鼠LXRα 和ABCA1 表達的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD 大鼠60 只，雄性，清潔級，體質(zhì)量180±20 g，購于河北省實驗動物中心，合格證號:1403039。

1.2 實驗用藥 消痰化瘀中藥由制半夏、建澤瀉、海藻、丹參、溫郁金、醋柴胡、生大黃、決明子、炒白術、生黃芪等組成，購自石家莊樂仁堂醫(yī)藥股份有限公司，水煎至所需濃度的溶液。東寶肝泰片(批號:H22024764)，通化東寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，用羧甲基纖維素鈉配制成符合要求的混懸液。

1.3 實驗試劑 甘油三酯 (TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白 (HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)試劑盒均購于北京中生生物工程高技術公司，一抗ERK1 兔抗IgG 多克隆抗體和二抗山羊抗兔購自武漢博士德生物技術有限公司，SP9001 試劑盒及DAB 顯色劑購自北京中山生物技術有限公司，Trizol 購自Invitrogen 公司，DEPC 購自Sigma 公司，RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker 購自TaKaRa 公司。

1.4 主要儀器 Humalyzer2000 半自動生化分析儀、高速冷凍離心機、VANOX AHB－LB 型OLYMPUS 萬能顯微鏡、PE9600 型PCR 擴增儀、Motic6.0 數(shù)碼醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)、凝膠圖象分析系統(tǒng)(法國VL 公司BIO－PROFIF)等。

2 實驗方法

2.1 動物造模與分組 隨機將SD 大鼠60 只分為6 組，每組10 只，分別是正常組、模型組、陽性藥(東寶肝泰)對照組和消痰化瘀中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組。正常組喂養(yǎng)給予一般飼料，其余各組參照文獻報道的方法［4］喂飼高脂飼料(膽固醇、豬油、豬膽酸鈉、甲基硫氧嘧啶、普通飼料的比例分別為1.5%、10.0%、0.5%、0.2%、87.8%)造模。

2.2 給藥方法 自大鼠喂飼高脂飼料的同時即給予相應的藥物灌胃，對照組東寶肝泰和消痰化瘀中藥高、中、低劑量組的給藥劑量標準分別為:0.90、43.34、32.50、21.67 g/kg，正常組、模型組均灌服和治療組同容量的蒸餾水，每天給實驗大鼠灌胃給藥1 次，各實驗組每次給藥采用相同體積，均按照1 mL/100 g 的標準實施，共用藥8 周。

2.3 標本采集方法 實驗大鼠最后1 次灌胃后，禁食12 h，然后麻醉，分離股動脈并取血，分離血清用于血脂檢測;取血后立即打開腹部、取出肝臟，先取少許肝組織迅速置于冷凍管中液氮保存，用于RT－PCR 法檢測;再取少許肝組織置于冰箱中冷凍保存，用于肝內(nèi)脂質(zhì)含量測定;同時取適宜大小的肝和小腸組織，4%多聚甲醛溶液固定，用于HE 染色和免疫組化觀察。

2.4 檢測方法

2.4.1 血脂和肝內(nèi)脂質(zhì)測定:血清TG、TC、HDL、LDL 和FFA 的含量以比色法用半自動生化分析儀測定;稱取冷凍的肝組織，制成10%的勻漿，吸取上清液，用722 型光柵分光光度計檢測TC 和TG 的含量。

2.4.2 肝組織病理學觀察:將固定的肝組織，常規(guī)HE 方法染色，鏡下觀察肝細胞的大小、形態(tài)、排列和肝細胞脂肪變性等。

2.4.3 免疫組化法觀察小腸組織中ABCA1 的表達:取固定的小腸組織，常規(guī)脫水、包埋、切片，采用免疫組織化學方法運用光鏡觀察，陽性表達的標準:呈現(xiàn)黃棕色粗顆粒或細膩顆粒分布。肝組織的陽性表達彌散在肝細胞內(nèi)，小腸組織的陽性表達在細胞漿內(nèi)。運用Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，在相同的放大倍數(shù)下，每張切片隨機選取6 個不同的視野進行計數(shù)，抗原表達數(shù)值以陽性細胞染色的平均光密度值(OD)值來表示。

2.4.4 RT－PCR 法檢測肝臟LXRα mRNA 的表達:采用Trizol 一步法提取總RNA。引物序列由primer 5.0 軟件設計。GAPDH:上游引物5＇－TCCT GACC CTGA AGTA CCCC ATTG－3 ＇;下游引物5＇－GGAA CCGC TCAT TGCC GATA GT－3 ＇擴增片段為576bp。LXRα:上游引物5＇－ACAA CCCT GGGA GTGA GAG－3＇;下游引物5＇－TAGC ATCC GTGG GAAC AT－3＇，擴增片段為308bp。應用RT－PCR 方法檢測，實驗重復3 次，以GAPDH 作為內(nèi)對照，計算相對含量。

3 結果

3.1 消痰化瘀中藥對大鼠血脂的影響 模型組大鼠血清TC、TG、LDL－C 和FFA 的含量高于正常組(P＜0.01)，而HDL－C 的含量則低于正常組(P＜0.01)。各用藥組大鼠血清TC、TG、LDL－C 和FFA 的含量均低于模型組 (P＜0.01)，HDL－C 的含量高于模型組(P＜0.01);其中消痰化瘀中藥高、中、低劑量組TC、TG、LDL－C和FFA 的含量均低于陽性藥組(P＜0.05 或P＜0.01)。結果見表1、表2。

表1 各組大鼠血清TG、TC、HDL 與LDL 的組間比較 (n=10，±s，mmol/L)

表1 各組大鼠血清TG、TC、HDL 與LDL 的組間比較 (n=10，±s，mmol/L)

注:與模型組比較，* P＜0.01;與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.001;與低劑量組比較，▲P＜0.05;與中劑量組比較，■P＜0.05

分組TC TG HDL LDL正常組 1.371±0.196* 0.512±0.093* 1.119±0.186* 0.440±0.050*模型組 3.298±0.256 1.180±0.153 0.719±0.098 2.743±0.466陽性藥對照組 2.131±0.352* 0.827±0.109* 1.123±0.131* 1.593±0.313*消痰化瘀高劑量組 1.484±0.239＊△△▲ 0.554±0.098＊△△▲ 1.480±0.219＊△△▲■ 0.885±0.181＊△△▲■消痰化瘀中劑量組 1.690±0.271＊△△ 0.574±0.093＊△△▲ 1.296±0.228＊△ 1.095±0.266＊△▲消痰化瘀小劑量組 0.669±0.105＊△△ 0.741±0.269＊△△ 1.305±0.233＊△ 1.215±0.289*

3.2 消痰化瘀中藥對大鼠肝組織TC、TG 含量的影響 模型組大鼠肝組織TC、TG 的含量高于正常組(P＜0.01);各用藥組大鼠肝組織TC、TG 的含量均低于模型組(P＜0.01)，其中，消痰化瘀中藥高、中、低3 個劑量組肝組織TC、TG 的含量均低于對照組(P＜0.05 或P＜0.01)。結果見表2。

表2 各組大鼠血清FFA 和肝組織TC、TG 的組間比較 (n=10，±s)

表2 各組大鼠血清FFA 和肝組織TC、TG 的組間比較 (n=10，±s)

注:與模型組比較，* P＜0.01;與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與中劑量組比較，■P＜0.05

分組 FFA (μmol/L) TC (mmol/L) TG (mmol/L)正常組 243.335±50.284* 6.129±0.843* 21.280±3.031*模型組 436.481±52.151 15.982±2.366 36.979±4.283對照組 324.050±56.061* 10.946±1.871* 29.591±4.376*消痰化瘀高劑量組 242.191±35.130＊△△ 7.145±0.819＊△△ 23.650±3.276＊△△消痰化瘀中劑量組 259.780±29.330＊△△ 8.592±0.948＊△▲ 24.409±3.150＊△△消痰化瘀小劑量組 277.622±34.284＊△▲ 9.963±1.044＊▲▲■ 26.368±3.598＊▲

3.3 消痰化瘀中藥對大鼠肝組織病理學的影響正常組大鼠的肝細胞排列規(guī)整、在中央靜脈周圍呈放射形狀，肝竇清晰可見，胞核形態(tài)、大小正常，胞漿分布均勻。模型組大鼠肝細胞排列嚴重紊亂，肝竇明顯擴大，細胞體積增大、形狀不規(guī)則，胞漿中可見大小不一、數(shù)目不等的脂肪空泡，胞核被擠向一側，呈現(xiàn)明顯的脂肪變性。消痰化瘀中藥各治療組大鼠肝細胞脂滴數(shù)量和空泡明顯減少，肝小葉和肝血竇的結構比較清晰，肝脂變程度均見明顯改善。

3.4 消痰化瘀中藥對大鼠肝臟LXRα mRNA 表達的影響 模型組大鼠肝臟LXRα mRNA 的表達明顯高于正常組(P＜0.01);各治療組肝臟LXRα mRNA 的表達水平均明顯降低(P＜0.01)。結果見表3。

3.5 消痰化瘀中藥對大鼠小腸組織ABCA1 表達的影響 半定量分析結果可見:模型組與正常組比較，小腸組織中ABCA1 蛋白表達量明顯降低(P＜0.01)，各用藥組均顯著增加大鼠小腸組織ABCA1 的蛋白表達量(P＜0.01)。結果見表3。

表3 各組大鼠肝組織LXRα mRNA 和小腸組織ABCA1 表達的組間比較 (n=6，±s)

表3 各組大鼠肝組織LXRα mRNA 和小腸組織ABCA1 表達的組間比較 (n=6，±s)

注:與模型組比較，* P＜0.01;與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與中劑量組比較，■P＜0.05

分組 LXRα ABCA1正常組 0.426±0.056* 0.436±0.033*模型組 1.337±0.216 0.166±0.019對照組 0.772±0.052* 0.261±0.035*消痰化瘀高劑量組 0.537±0.059＊△△ 0.416±0.053＊△△消痰化瘀中劑量組 0.605±0.072＊△△▲ 0.325±0.048＊△△▲消痰化瘀小劑量組 0.691±0.083＊△▲▲■ 0.308±0.041＊△▲▲

4 討論

NAFLD 是一種隱匿性肝病，已成為發(fā)達國家第一大肝病，但其確切的發(fā)病機制尚不十分明確，目前認為脂質(zhì)代謝異常、胰島素抵抗、氧應激及脂質(zhì)過氧化、免疫反應損害等因素均可能參與NAFLD 的發(fā)病?，F(xiàn)在比較接受的是Day［5］提出的二次打擊學說，初次打擊主要是脂質(zhì)代謝紊亂及胰島素抵抗，導致肝細胞脂肪蓄積，引起單純性脂肪肝;二次打擊主要是氧化應激及炎癥因子的浸潤，從而引起脂肪性肝炎和肝纖維化。由此可見脂質(zhì)代謝異常是NAFLD 發(fā)病機制中最關鍵也是最基礎的環(huán)節(jié)之一。

LXRs 是氧化性固醇激活的核受體超家族成員，LXRα 是LXRs 的亞型，LXRα 被稱為膽固醇的感受器，與肌體脂質(zhì)代謝密切相關，在肝臟高表達。ABCA1 是LXRs 的靶基因之一。LXR 被激活后，ABCA1、ABCG1 基因表達增強，促進體內(nèi)膽固醇從腸的上皮細胞中轉運至腸腔，從而抑制膽固醇的吸收;同時，促使巨噬細胞中的膽固醇向血液中的排放量進一步增加，進入血中的膽固醇由HDL 再轉運回肝，最后以膽汁酸或者游離膽固醇的形式排出體外。［6－7］而且，腸上皮細胞內(nèi)的膽固醇排入腸腔的量也隨ABCG1、ABCA1 的表達增強而增加，最終隨糞便排出體外。［8］

消痰化瘀中藥為筆者經(jīng)過臨床反復篩選組成的治療NAFLD 有效方藥，選用制澤瀉、半夏利水除濕、消散痰濁;丹參、郁金活血通絡;生大黃瀉腑導滯，降濁祛脂;生山楂活血祛瘀，降脂;柴胡、決明子疏利肝膽，并能降脂;黃芪、炒白術益氣健脾，以助痰濁瘀血的運除。諸藥配用，具有消痰祛濁，活血化瘀之功。上述藥物作用于高脂飲食誘導的NAFLD 大鼠后發(fā)現(xiàn)，消痰化瘀中藥能夠顯著降低血清TG、TC、HDL、LDL、FFA 和和肝組織TC、TG 的含量;減輕肝臟脂肪變性的程度;促進肝組織LXRα mRNA 及小腸組織ABCA1 的表達。研究結果提示，消痰化瘀中藥對NAFLD 的治療作用可能是通過對LXRα/ABCA1 這一通路的調(diào)控來改善脂代謝紊亂而實現(xiàn)的。

［1］劉淵，馬雄.肝臟X 受體及非酒精性脂肪性肝?。跩］.肝臟，2009，14 (5):412－414

［2］張曉菲，譚曉華，楊坤.ABCA1 在膽固醇逆轉運中作用的研究進展［J］.健康研究，2010，30 (3):214－217

［3］劉連臣，徐晶，梁曉莉，等.消痰化瘀法治療痰瘀互結型高脂血癥52 例臨床觀察［J］.河北中醫(yī)藥學報，2013，28(3):20－21

［4］戴寧，曾民德，李繼強，等．復方中藥抑制非酒精性脂肪肝肝細胞色素P450ⅡE1 表達的實驗研究［J］．中國中西醫(yī)結合雜志，2000，20 (6):453－455

［5］Day CP.Non－alcoholic fatty liver disease:Current concepts and management strategies ［J］.Clin Med，2006，6 (1):19－25

［6］Gelissen IC，Harris M，Rye KA，et al.ABCA1 and ABCG1 synergize to mediate cholesterol export to ApoA2I［J］.JArterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26 (3):534－540

［7］Matsuura F，Wang N，Chen WG，et al.HDL from CETP2 deficient subjects shows enhanced ability to promote cholesterol efflux from macrophages in an apoE2and ABCG12 dependent pathway［J］.J Clin Invest，2006，116 (5):1 435－1 442

［8］Klucken J，Buchler C，Orso E，et al.ABCG1 (ABC8)，the human homolog of the Drosophila whie gene is a regulator of macrophage cholesterol and phospholipids transport ［J］.J Proc Natl Acad Sci USA，2000，97 (2):817－822