河北中醫(yī)學(xué)院 (石家莊050091)

陳進(jìn)成 丁 芳△ 王 亮△ 楊淑英△△ 李春香 張 煒

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎藏精、主生殖，為先天之本”“肝藏血、主疏泄，女子以肝為先天”，肝腎兩個“先天”決定其在女性生理、生殖的調(diào)節(jié)上發(fā)揮著極其重要的作用。基于此，中醫(yī)婦科臨床補腎滋腎、疏肝養(yǎng)肝法成為主要的治療原則。［1］在卵巢分泌的甾體性激素作用下，子宮內(nèi)膜經(jīng)歷著增殖、分化、崩解和修復(fù)的周期性變化，［2］近年生理生殖領(lǐng)域應(yīng)用小鼠建立的月經(jīng)模型為月經(jīng)的機(jī)制研究以及月經(jīng)性疾病的病理研究提供了優(yōu)良的平臺，［3－5］而研究的重點大都集中在子宮內(nèi)膜的蛻膜化、崩解與早期修復(fù)環(huán)節(jié)。本研究則以生理性孕酮撤退的小鼠月經(jīng)模型為平臺，觀察補腎方與調(diào)肝方對子宮內(nèi)膜崩解前受性激素調(diào)控的增殖期和分泌期的影響，并對其影響因子子宮系數(shù)、血清中雌激素(E2)、孕激素(P)含量、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及血管內(nèi)皮因子(VEGF)的表達(dá)對比研究，以期為臨床根據(jù)子宮內(nèi)膜時相合理用藥提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量18～20 g，8～10 周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號:SCXK(京)2009－0004。

1.2 藥品與試劑 補腎方由熟地黃15 g，澤瀉10 g，炒山藥、沙苑子、枸杞子、巴戟天各15 g，肉桂4 g 等組成;調(diào)肝方由柴胡10 g，白芍、當(dāng)歸、香附各15 g，玫瑰花12 g，炒白術(shù)、茯苓各15 g 等組成;購于石家莊樂仁堂。將上述中藥煎煮濃縮，制成含生藥量為1.0 g/mL 的藥液，4℃貯存?zhèn)溆?。β－雌二?(E2，德國Alfa Aesar 公司，批號10152011)，孕酮 (P，美國Sigma 公司，批號P8783)。碘［125I］雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒，批號RG61405，碘［125I］孕酮(Prog)放射免疫分析藥盒，批號RG51406D，天津九鼎生物工程有限公司。ER－α 抗體，批號980593 w，PR 抗體，批號20140603，VEGF 抗體，批號131210 w，β－actin，批號:140103 w，北京博奧森生物科技有限公司。二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)，批號106484，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器BX53 型顯微鏡，OLYMPUS (日本);E4500 型微距攝像機(jī)，Nikon (日本)。

2 方法

2.1 動物分組與造模 C57BL/6J 雌性小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、補腎組、調(diào)肝組、調(diào)理肝腎組，每組10 只。除假手術(shù)組外，模型組與各給藥組小鼠基于Brasted 等［4－5］的小鼠模型并進(jìn)行適當(dāng)修改建立小鼠月經(jīng)模型。小鼠在乙醚麻醉下行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，恢復(fù)1 周清除內(nèi)源性激素干擾。按程序進(jìn)行激素處理:第1～3 天皮下注射100 ng/d E2;第5～6 天無處理;第7 天將孕酮管皮下埋植于小鼠背部皮膚松弛處，并同時皮下注射50 ng/d 的P 和5 ng/d 的E2;第8～9 天皮下注射5 ng/d E2。

2.2 動物給藥 灌胃方案:補腎組連續(xù)9 天灌胃補腎方;調(diào)肝組連續(xù)9 天灌胃調(diào)肝方;補腎調(diào)肝組于第1～4 天灌胃補腎方，5～9 天灌胃調(diào)肝方;各組給藥量均為30.83 g/kg;假手術(shù)組與模型組每日給予等量的生理鹽水。各組用藥量均按人與動物的體表面積進(jìn)行換算。［6］

2.3 樣本采集 小鼠于程序處理的第4 天處死為T1 點，第9 天處死為T2 點。在取材點將小鼠摘眼球取血，以3 000 r/min，15 min 離心分離血清;取子宮，迅速與周圍脂肪組織分離，拍照;部分子宮組織立即固定于4%多聚甲醛;部分組織立即置液氮中急凍，后轉(zhuǎn)入－80℃保存，用于Real－time PCR 與Western blotting 蛋白印跡檢測。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 子宮角外觀、子宮系數(shù)與形態(tài)學(xué)觀察:將子宮組織與外周脂肪組織分離，拍照觀察子宮角外觀形態(tài)，稱重。計算子宮系數(shù)(小鼠子宮角濕重與小鼠體質(zhì)量的比)=子宮濕重/體質(zhì)量×100%。4%多聚甲醛固定的組織經(jīng)梯度脫水后常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，用于H＆E 染色，鏡下觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化。

2.4.2 血清激素E2、P 的測定:采用放射免疫法測定血清中E2、P 的含量，嚴(yán)格按照藥盒的說明書操作。

2.4.3 免疫組化法檢測子宮組織ER－α、PR、VEGF 蛋白的表達(dá):石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟復(fù)水，用檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，加一抗(1︰200)4℃過夜，二抗室溫孵育20 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。圖像分析依據(jù)陽性免疫反應(yīng)的圖像灰度選擇合適的灰度分割閾值，實現(xiàn)雙閾值分割，得到半灰度目標(biāo)圖像，以人機(jī)交互方式測定陽性免疫染色強度及面積，每個切片測5 個視野，由計算機(jī)計算出所測陽性反應(yīng)物積分光密度(IOD)值，評價表達(dá)的強弱。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，對所測結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗。組內(nèi)比較采用t 檢驗，組間比較采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)，兩兩比較用LSD 檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠子宮系數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組子宮系數(shù)顯著性升高(P＜0.05);與模型組比較，各給藥組子宮系數(shù)顯著升高 (P＜0.05);與補腎組比較，調(diào)肝組與補腎調(diào)肝組在T2點子宮系數(shù)顯著升高(P＜0.05);與調(diào)肝組比較，補腎組與補腎調(diào)肝組在T1 點子宮系數(shù)顯著升高(P＜0.05)，如表1所示。

表1 各組小鼠子宮系數(shù)比較 (±s)

表1 各組小鼠子宮系數(shù)比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較，* P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與補腎組比較，▲P＜0.05;與調(diào)肝組比較，#P＜0.05

組別 樣本數(shù) T1 點 T2點假手術(shù)組 10/10 0.271±0.066 0.269±0.071模型組 8/7 0.405±0.064* 0.301±0.019*補腎組 8/7 0.550±0.036＊△# 0.316±0.025＊△調(diào)肝組 8/9 0.480±0.021＊△ 0.379±0.028＊△▲補腎調(diào)肝組 9/8 0.548±0.041＊△# 0.426±0.033＊△▲

3.2 各組小鼠子宮組織形態(tài)學(xué)觀察 假手術(shù)組子宮角在整個過程中上皮完整，功能層細(xì)胞排列緊密，基底層間質(zhì)細(xì)胞無明顯變化。模型組，在E2作用下的T1 點，肉眼下可見小鼠子宮角腫大，內(nèi)有液體充盈，外周血管密集;H＆E 染色可見子宮內(nèi)膜呈單層立方上皮，核質(zhì)較高，細(xì)胞核呈橢圓狀，基質(zhì)疏松。而在E2、P 聯(lián)合作用下的T2 點，子宮體呈現(xiàn)紅色，管腔未見腫大;H＆E 染色后內(nèi)膜呈假復(fù)層改變，見分泌細(xì)胞，腔內(nèi)現(xiàn)分泌物。與模型組比較，各給藥組小鼠子宮的變化呈現(xiàn)相似的趨勢，如圖1所示。

圖1 小鼠子宮外觀形態(tài)與H＆E 染色，黑色方框標(biāo)明位置的高倍視野(×100 與×400)，S 為假手術(shù)組及其高倍視野(×400)

3.3 各組小鼠血清中E2、P 含量的比較 與假手術(shù)比較，模型組血清中的E2、P 的含量均顯著性增加(P＜0.05);與模型組比較，各給藥組血清中的E2、P 的含量增加，但差異沒有顯著性(P＞0.05)，如表2示。

3.4 各組小鼠子宮組織中ER－α、PR 與VEGF表達(dá)的比較 免疫組織化學(xué)法檢測顯示假手術(shù)組小鼠子宮角可見ER－α、PR 與VEGF 的較弱陽性表達(dá)。ER－α 的陽性信號位于間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中;PR 陽性信號在上皮周圍的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá);VEGF的陽性信號于間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的表達(dá)明顯上調(diào) (P＜0.05);與模型組比較，各給藥組小鼠的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05);與補腎組比較，調(diào)肝組與補腎調(diào)肝組在T2 點的表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);與調(diào)肝組比較，補腎組與補腎調(diào)肝組在T1 點的表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，如表3所示。

表2 各組小鼠血清E2、P 的含量與比較 (±s)

表2 各組小鼠血清E2、P 的含量與比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較，* P＜0.05

組別 樣本E2 (pg/mL)P (ng/mL)T1 點 T2點T1 點 T2點假手術(shù)組 10/10 8.253±0.812 9.639±0.719 0.622±0.316 0.706±0.434模型組 8/7 19.453±1.021* 41.320±0.743* 1.543±0.374* 78.981±2.662*補腎組 8/7 21.245±0.951* 42.114±0.913* 1.603±0.953* 79.826±1.493*調(diào)肝組 8/9 20.791±1.011* 41.833±2.002* 1.576±0.241* 80.233±1.092*調(diào)理肝腎組 9/8 21.102±0.803* 42.442±1.271* 1.595±0.213* 80.284±2.512*

表3 免疫組化測得各組小鼠子宮組織ER－α、PR 與VEGF 表達(dá)強弱的比較 (±s)

表3 免疫組化測得各組小鼠子宮組織ER－α、PR 與VEGF 表達(dá)強弱的比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較，* P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與補腎組比較，▲P＜0.05;與調(diào)肝組比較，#P＜0.05

組別 樣本 ER－α T1 點 T2點PR T1 點 T2點VEGF T1 點 T2點假手術(shù)組 10/10 2.3±1.1 2.8±1.4 3.1±1.2 2.9±1.0 5.2±2.4 6.8±3.0模型組 8/7 15.4±2.2* 13.3±3.7* 25.5±2.7* 38.8±2.6* 43.1±3.4* 57.5±4.1*補腎組 8/7 21.6±1.9＊△# 19.1±3.2＊△ 36.1±2.5＊△# 46.8±4.9＊△ 56.4±3.1＊△# 70.3±4.7＊△調(diào)肝組 8/9 18.9±2.3＊△ 34.8±2.7＊△▲ 31.5±2.4＊△ 50.2±3.0＊△▲ 50.1±4.2＊△ 79.5±3.9＊△▲調(diào)理肝腎組 9/8 21.7±1.8＊△# 39.0±2.1＊△▲ 36.3±2.2＊△# 55.9±3.1＊△▲ 56.3±3.8＊△# 87.8±6.1＊△▲

4 討論

女子月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜有著從增殖、分泌到崩解修復(fù)的特征性變化，并參考國內(nèi)外有關(guān)研究［3－5］建立的小鼠月經(jīng)模型，觀察子宮內(nèi)膜的形態(tài)和功能變化以及影響的因素，可以進(jìn)一步闡明月經(jīng)的生理、病理機(jī)制，由此研究增殖期和分泌期的子宮內(nèi)膜變化以及影響因素尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，此小鼠月經(jīng)模型在組織學(xué)上顯示出與人類子宮內(nèi)膜的周期性變化類似的特征，即在單純雌激素作用時與人類增殖期內(nèi)膜上皮細(xì)胞相似;雌、孕激素聯(lián)合作用時，則與人類中晚分泌期子宮內(nèi)膜的特征相似。［7］

補腎方以金匱腎氣丸加減化裁而成，方中熟地黃、枸杞子滋補肝腎之陰，山藥補脾澀精，以助滋補腎中之陰，巴戟天、沙苑子、肉桂溫補腎中之陽，生少火以助腎氣，加澤瀉可補中寓瀉，補而不滯，縱觀全方則溫補腎陽而不燥、滋補腎陰而不膩，陰陽雙補。調(diào)肝方則以逍遙散加減化裁，此方在婦科疾病應(yīng)用頗多，［8］方中當(dāng)歸、白芍滋養(yǎng)肝血，柴胡、香附、玫瑰花疏肝理氣，輔以茯苓、白術(shù)培補脾土，滋氣血生化之源，兼能養(yǎng)肝調(diào)肝。如此配伍則補肝體、助肝用，氣血兼顧?，F(xiàn)代研究補腎藥、調(diào)肝藥有類似激素樣調(diào)節(jié)作用。［9－11］

本研究一方面通過切除小鼠卵巢來阻斷內(nèi)源性激素的干擾，另一方面則在定量激素替代的基礎(chǔ)上給予中藥復(fù)方干預(yù)，并采用子宮濕重與體質(zhì)量的比值作為檢測中藥激素活性的方法，［10］加之血清中激素含量的測定，子宮內(nèi)膜組織中相應(yīng)激素受體表達(dá)的測定進(jìn)行綜合驗證。結(jié)果提示:各給藥組與模型組比較均增加了血清中的雌、孕激素含量，但差異無顯著性。這也說明了中藥的激素樣作用是比較緩和的，且激素的生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮主要是與其受體的親和性有關(guān)，與文獻(xiàn)研究相一致。［10］在T1 點，即雌激素調(diào)控的增殖期，補腎組與調(diào)理肝腎組小鼠子宮組織中ER－α、PR、VEGF 的表達(dá)均顯著上調(diào);在T2 點，即雌、孕激素聯(lián)合調(diào)控的分泌期，調(diào)肝組與調(diào)理肝腎組小鼠ER－α、PR、VEGF 的表達(dá)均顯著上調(diào)。

綜上，激素受體的表達(dá)水平?jīng)Q定了相應(yīng)激素的生物學(xué)效應(yīng)，雌、孕激素與其受體的親和性以及血管發(fā)生關(guān)鍵因素［12］的變化影響到了子宮內(nèi)膜的形態(tài)和功能，故根據(jù)子宮內(nèi)膜增殖期、分泌期采用不同方藥進(jìn)行調(diào)節(jié)彰顯了中醫(yī)辨病與辨證相結(jié)合，以及因時制宜的特色。本研究也提示，在雌激素調(diào)控的增殖期，補腎滋腎較宜;在雌、孕激素共同調(diào)控的分泌期，則宜疏肝養(yǎng)肝。調(diào)理肝腎按月經(jīng)周期用藥更適合調(diào)整子宮內(nèi)膜的狀態(tài)和功能，這也是我們將來進(jìn)一步研究的重點。

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