曾小飚 黃斌 陳冠喜 莫遠(yuǎn)明 李毅

摘 要：試驗(yàn)研究了不同濃度As3+脅迫對(duì)麻風(fēng)樹幼苗生理生化指標(biāo)的影響，探討其對(duì)As3+污染的耐受性，為其是否能被安全引種馴化及種植推廣提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，隨著As3+濃度的增加，麻風(fēng)樹幼苗葉片的可溶性蛋白、葉綠素含量以及過(guò)氧化物酶（POD）的活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，而游離脯氨酸（Pro）、可溶性糖、MDA含量則呈上升的趨勢(shì)，說(shuō)明低濃度的砷在麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)產(chǎn)生的毒害作用較小，而麻風(fēng)樹幼苗對(duì)高濃度砷表現(xiàn)出較高的耐受性。

關(guān)鍵詞：麻風(fēng)樹；砷脅迫；生理生化指標(biāo)；影響

中圖分類號(hào) S727.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）21-38-03

麻風(fēng)樹具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是生物柴油新能源的植物之一[1]，近年來(lái)，隨著可再生能源研究的深入，作為一種重要的油料植物[2]，因其種植不占農(nóng)田、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。與此同時(shí)，由于工業(yè)的迅猛發(fā)展，工業(yè)“三廢”的大量排放，使得大面積的土壤受到了重金屬的污染[3]，因此，在大規(guī)模種植麻風(fēng)樹的過(guò)程當(dāng)中，易受到重金屬的毒害。砷是一種有毒的類金屬物質(zhì)，與其化合物一起被應(yīng)用在農(nóng)藥、除草劑、殺蟲劑等方面，隨著農(nóng)藥、除草劑、殺蟲劑的大量使用，大量的As3+進(jìn)入到自然環(huán)境中，造成嚴(yán)重的污染。在中國(guó)因土法采礦和私營(yíng)企業(yè)煉砷造成小范圍砷污染土壤問(wèn)題相當(dāng)突出，在某些采礦點(diǎn)附近土壤砷含量高達(dá)28 522mg/kg[4]，其對(duì)許多植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著的危害。例如，楊桂娣等[5]報(bào)道了隨著砷濃度的升高，水稻根和葉中超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶的活性受到了顯著抑制。蔣漢明等[6]綜述了不同濃度砷及不同形態(tài)砷對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，以及耐砷植物及植物耐砷機(jī)理。金晶煒等[7]報(bào)道了低濃度砷對(duì)生菜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、芽長(zhǎng)和幼苗干重具有激活效應(yīng)，而對(duì)種子的活力指數(shù)和幼苗根長(zhǎng)具有抑制效應(yīng)，高濃度砷對(duì)生菜種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有顯著的抑制效應(yīng)，且隨著砷脅迫的增強(qiáng)，抑制作用增強(qiáng)。姜志艷等[8]報(bào)道了隨著砷濃度升高，黃芪葉片中這3種酶的活性能夠維持，特別是POD活性顯著增加。但目前關(guān)于As3+污染對(duì)麻風(fēng)樹幼苗的生理生態(tài)指標(biāo)的影響尚未有報(bào)道。為此，本文以麻風(fēng)樹幼苗為試驗(yàn)材料，通過(guò)不同濃度砷離子的處理，測(cè)定麻風(fēng)樹幼苗生理生化指標(biāo)的變化，研究砷脅迫對(duì)其生理生化指標(biāo)的影響，并探討其在砷污染環(huán)境下生長(zhǎng)的適應(yīng)性，旨在為麻風(fēng)樹的安全引種馴化及種植推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試種子為麻風(fēng)樹種子，采自百色野外的山林。將麻風(fēng)樹種子用自來(lái)水沖洗干凈，用蒸餾水沖洗3次，再用蒸餾水浸泡12h，取出后用高錳酸鉀溶液（濃度為1∶5 000）消毒10min。在培養(yǎng)盤里鋪上一層棉花，再鋪上一層濾紙，將處理好的麻風(fēng)樹種子均勻擺置在培養(yǎng)盤上，澆上適量的蒸餾水后蓋上一層紗布，將其置于25℃、濕度為75%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7d后種子萌發(fā)，待根長(zhǎng)到2cm時(shí)將其移栽到盛有干凈河沙的塑料盆中用蒸餾水培養(yǎng)，待長(zhǎng)出2片葉子后開始用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，待進(jìn)行砷脅迫試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 幼苗長(zhǎng)出4～6片葉子后，將其移栽到盛有不同As3+濃度梯度溶液的塑料盆中，每盆移栽5苗。為了能迅速直接地觀察到不同濃度砷脅迫對(duì)麻風(fēng)樹幼苗生長(zhǎng)的影響，分別用As3+濃度為0、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、150mg/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)，共7個(gè)As3+濃度梯度。每個(gè)梯度15盆，5d澆1次200mL相應(yīng)濃度的As3+培養(yǎng)液，28d后測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.3 測(cè)定方法 分別取各As3+濃度梯度幼苗葉片2份，摘取時(shí)間8：00～9：00。其中1份用去離子水沖洗3次，105℃殺青30min，80℃烘干4h，分裝后于4℃冰箱保存，用于葉綠素、還原糖和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定。丙酮法測(cè)定葉綠素含量，DNS（3，5-二硝基水楊酸法）比色法測(cè)定還原糖含量，巴比妥酸（TBA）顯色法測(cè)丙二醛（MDA）含量[9]。另1份用去離子水沖洗3次后，加入適量預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8，含有1%聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂于冰浴上勻漿，4℃下離心20min，取上清液用于脯氨酸含量、可溶性蛋白含量和過(guò)氧化物酶活性測(cè)定。茚三酮顯色法測(cè)定脯氨酸含量，考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定可溶性蛋白含量，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性[9]。上述試驗(yàn)均為3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，各濃度梯度材料與對(duì)照組（As3+濃度0mg/L）材料的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的差異顯著性分析采用SPSS11.5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同As3+濃度對(duì)麻風(fēng)樹幼苗葉片葉綠素、可溶性糖及丙二醛含量的影響

2.1.1 葉綠素含量 葉綠素含量是反映光合作用水平的重要指標(biāo)，葉綠素含量降低，光合作用能力也會(huì)相對(duì)減弱，植物生長(zhǎng)受到抑制[10]。由表1看出，隨著砷的濃度的增加，麻風(fēng)樹苗的葉綠素含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)植株受到低濃度砷脅迫時(shí)，葉綠素含量小幅上升，并在As3+濃度較小時(shí)出現(xiàn)最大值（60mg/L），但隨著As3+濃度的繼續(xù)增加，葉綠素含量又呈下降趨勢(shì)。

2.1.2 可溶性糖含量 麻風(fēng)樹幼苗在不同砷濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)后，幼苗葉片中可溶性糖含量呈上升的趨勢(shì)（表1）。說(shuō)明在一定濃度的砷脅迫下，麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)的生理應(yīng)答機(jī)制會(huì)受到一定程度的刺激而促進(jìn)可溶性糖的合成。

2.1.3 丙二醛含量 由表1可看出，隨著砷濃度的增加，麻風(fēng)樹幼苗葉片的丙二醛（MDA）含量呈上升的趨勢(shì)。植物在逆境中，細(xì)胞原生質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸會(huì)發(fā)生過(guò)氧化作用產(chǎn)生MDA，因而MDA含量可反映膜脂過(guò)氧化作用的強(qiáng)弱[11]。由此推測(cè)，隨著砷濃度的增加，麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)產(chǎn)生并積累大量活性氧引發(fā)了膜脂的過(guò)氧化也有上升的趨勢(shì)。

2.2 不同As3+濃度對(duì)麻風(fēng)樹幼苗葉片可溶性蛋白、脯氨酸（Pro）含量的影響 可溶性蛋白和脯氨酸含量是了解植物生理生化變化的重要途徑。脯氨酸的積累在一定程度上反映了植物受重金屬脅迫情況及其對(duì)重金屬的忍耐和抵抗力[12]。由表1看出，隨著砷濃度的增加，麻風(fēng)樹幼苗葉片可溶性蛋白呈先上升后下降的趨勢(shì)，而脯氨酸含量則呈上升的趨勢(shì)。說(shuō)明麻風(fēng)樹幼苗對(duì)砷較敏感，且一定濃度的砷脅迫在幼苗體內(nèi)產(chǎn)生了一定程度的損害。

2.3 不同As3+濃度對(duì)麻風(fēng)樹幼苗葉片POD活性的影響 過(guò)氧化物酶（POD）與植物抗性密切相關(guān)，是植物體內(nèi)的保護(hù)酶，也是重要的抗氧化酶類，可以將植物體內(nèi)的H2O2有效地清除[13-14]。過(guò)氧化物酶活性高，抗逆性強(qiáng)，反之則弱，其活性值在一定程度上反應(yīng)了植物對(duì)逆境的耐受能力。由表1看出，隨著砷濃度脅迫程度加大，麻風(fēng)樹幼苗葉片的POD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，但變化程度小。

3 結(jié)論與討論

植物通常是通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)的代謝活動(dòng)來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境的變化。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的必需物質(zhì)，是反應(yīng)植物葉片生理生化的重要指標(biāo)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，砷脅迫對(duì)麻風(fēng)樹幼苗葉片葉綠素含量有顯著影響，當(dāng)植株受到低濃度砷脅迫時(shí)，葉綠素含量有小幅上升，但隨著砷濃度增加，葉綠素含量又呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明高濃度As3+在幼苗體內(nèi)產(chǎn)生一定的毒害作用，As3+可能與葉綠體中蛋白質(zhì)上的巰基結(jié)合或取代其中的Fe2+、Zn2+和Mg2+，破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能[16]，從而使幼苗葉片內(nèi)葉綠素含量降低。

可溶性糖是植物體滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，有維持植物細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麻風(fēng)樹幼苗葉片的可溶性糖含量隨As3+濃度的升高呈上升的趨勢(shì)。說(shuō)明一定濃度的砷在麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)可促進(jìn)植物的代謝活動(dòng)，從而促進(jìn)可溶性糖的合成。

丙二醛（MDA）是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，如細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物中就含有MDA，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷[18]。因而MDA含量的高低一定程度上可表示細(xì)胞膜的損傷程度，也間接的反映植物組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受砷脅迫的麻風(fēng)樹幼苗葉片中的MDA含量隨砷濃度升高而升高，說(shuō)明砷脅迫使麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的活性自由基而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞膜系統(tǒng)也受到不同程度的損傷。但隨著砷濃度逐漸升高，幼苗葉片內(nèi)的MDA含量也在增加，一定程度上表明麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)的生理應(yīng)答機(jī)制在砷脅迫下作出較有效的反應(yīng)且逐步適應(yīng)砷污染的環(huán)境。

脯氨酸在逆境條件下的作用是作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[20]，保持原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失，逆境下可用作反映植物抗逆性的參考性生理指標(biāo)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受砷脅迫后麻風(fēng)樹幼苗葉片的可溶性蛋白呈先上升后下降的趨勢(shì)，而脯氨酸含量則呈上升的趨勢(shì)。說(shuō)明麻風(fēng)樹幼苗對(duì)砷的較敏感，這可能是由于砷在麻風(fēng)樹幼苗的體內(nèi)大量積累，導(dǎo)致脯氨酸和蛋白質(zhì)的合成及外源吸收途徑遭到破壞[22]，從而使麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)脯氨酸及蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生一定的變化。

在植物體內(nèi)，POD在機(jī)體清除有毒物質(zhì)的過(guò)程中具有重要的意義[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著砷濃度脅迫加重，麻風(fēng)樹幼苗葉片的POD活性呈略微的先上升后下降的趨勢(shì)。可推測(cè)在砷脅迫下，麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)多種功能膜及酶系統(tǒng)有相應(yīng)的防御反應(yīng)，但是由于砷濃度較小，其對(duì)麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)酶系統(tǒng)的破壞程度較小，因而POD活性變化較小。

綜上，麻風(fēng)樹幼苗在砷脅迫環(huán)境中生長(zhǎng)，其主要生理生化指標(biāo)如可溶性蛋白、葉綠素含量以及過(guò)氧化物酶（POD）的活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，且POD活性變化較小，而游離脯氨酸（Pro）、可溶性糖、MDA含量則有上升的趨勢(shì)，說(shuō)明低濃度的砷在麻風(fēng)樹幼苗體內(nèi)產(chǎn)生的毒害作用較小，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育并沒有出現(xiàn)明顯的抑制作用，而麻風(fēng)樹幼苗對(duì)高濃度砷則表現(xiàn)出較高的耐受性。

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（責(zé)編：張宏民）