胡恒宇，趙東風，劉春爽

（中國石油大學化學工程學院，山東青島266580）

碳同位素標記法鑒別芳烴降解菌研究

胡恒宇，趙東風，劉春爽

（中國石油大學化學工程學院，山東青島266580）

從油田采出水中富集培養(yǎng)石油烴降解菌，利用13C標記的甲苯作為碳源和變性梯度凝膠電泳技術(shù)，從中鑒定和考察能夠降解甲苯的細菌群落。結(jié)果表明：從采出水中富集培養(yǎng)的復(fù)合菌群經(jīng)過500 d的厭氧降解，對石油烴降解率達到36.4%，甲烷產(chǎn)量為201.2 μmol；以13C標記的甲苯為碳源，經(jīng)過60 d的培養(yǎng)，復(fù)合菌群對其降解率達到67%，12C標記的甲苯降解率為69%，兩種碳源標記甲苯的降解率差異不顯著；將離心中的重帶13C-DNA片段回收測序，鑒別出3種芳烴降解菌。

碳同位素；菌株鑒定；CsCl密度梯度；DGGE分析；芳烴

油藏環(huán)境中的有機物質(zhì)（特別是殘余原油）降解過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物和氣體，參與石油降解的菌群形成互營共生關(guān)系，最終使有機質(zhì)一步步地降解［1］。油藏環(huán)境中的微生物群體是由微好氧菌和兼性厭氧型細菌組成的，油藏中的脂肪烴提供了它們存活的基礎(chǔ)。油藏中的菌群有發(fā)酵菌、硫酸鹽/硝酸鹽還原菌、鐵還原菌、厭氧產(chǎn)甲烷菌等［2-4］，分屬于不同的菌屬，在自然狀態(tài)下可以降解和利用石油烴，但是單純利用內(nèi)源微生物，在自然狀態(tài)下的石油烴降解效率低［5］?，F(xiàn)有的細菌群落分析技術(shù)，如通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增和變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)，雖然可以很好地分析石油烴降解微生物的群落結(jié)構(gòu)，但不能準確分離降解芳烴的菌［6］。用穩(wěn)定性同位素探針（SIP）和DGGE技術(shù)結(jié)合可以準確分析和鑒定石油烴降解菌群的結(jié)構(gòu)［7-8］。筆者利用13C標記的和未標記的芳烴分別作為碳源，使菌群利用碳源合成自身的核酸（DNA），帶有13C的DNA片段會在氯化銫（CsCl）密度梯度中和其他DNA片段分離，從而鑒別分離出高效芳烴類降解菌。

1 試驗設(shè)計與方法

1.1 藥品與儀器

13C標記的甲苯標準品（國家標準物質(zhì)信息中心購買，美國）、12C標記的甲苯標準品（色譜純）、氯化銫CsCl、己烷（分析純）、二硫化碳、厭氧工作站（Plas Labs，Lansing，MI，USA）、OIL-510型紅外分光測油儀、貝克曼庫爾特高速離心機Optima L-XP（美國）、日本愛宕手持折射儀R-5000、吉爾森Minipuls 3蠕動泵。

1.2 石油烴降解菌群的初級培養(yǎng)

菌溶液為復(fù)合石油烴降解菌群，經(jīng)過實驗室長期培養(yǎng)和保存。具體培養(yǎng)方法為：采集來自油田的采出水，從采油井泵取保存于塑料桶（約10 L）中，立即送到實驗室并富集培養(yǎng)。取樣地油井的油層溫度為50～65℃，油層壓力為9～10 MPa，原油密度（0.929±0.04）g/cm3，原油黏度（168.4 ±3.0）mPa·s，總礦化度9.563 g/L，飽和分（33.9±0.7）%，芳香分（32.7±0.7）%，膠質(zhì)（28.6±0.6）%，瀝青質(zhì)（4.9±0.1）%。驅(qū)油類型為聚丙烯酰胺驅(qū)。

在厭氧操作箱中，首先進行初級培養(yǎng)，用紅外測油儀測定采出水中石油烴含量為0.05 g/mL。后取50 mL的采出水和5 g原油、50 mL滅菌無機鹽培養(yǎng)基充入到150 mL無菌瓶中，進行50℃的富集培養(yǎng)，以滅菌作為對照，多組培養(yǎng)。經(jīng)過實驗室500 d的培養(yǎng)，篩選出高效降解石油烴的復(fù)合菌群，表1是其石油降解率、CH4產(chǎn)量隨著天數(shù)的變化情況，每次測定重復(fù)5次。

表1 復(fù)合石油烴降解菌的降解參數(shù)Table 1 Characteristics of complex hydrocarbon degradation bacteria

對降解前后的石油烴萃取后進行四組分分離，再通過氣相色譜質(zhì)譜連用得知其降解前后的石油中飽和烴變化情況，結(jié)果見圖1和圖2，可以確定這是高效石油烴降解菌群，可以在后續(xù)試驗時，從中鑒別出哪些是芳烴類降解菌。

圖1 降解前飽和烴的氣相色譜-質(zhì)譜總離子圖Fig.1 Saturated hydrocarbon GC-MS TIC map before degradation

所用無機鹽培養(yǎng)基：KH2PO45.0 g；K2HPO45.0 g；NH4Cl 5.0 g；NaCl 1.0 g；MgCl22.0 g；CaCl20.1 g；酵母粉1.0 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g；定容到1 L；pH值7.0～7.2。

圖2 降解后飽和烴的氣相色譜-質(zhì)譜總離子圖Fig.2 Saturated hydrocarbon GC-MS TIC map after degradation

1.3 芳烴降解培養(yǎng)

通過《化學化工物性數(shù)據(jù)手冊》查得，在本實驗的50℃下，1 L水中最多可以溶解0.588 g甲苯，所以進行本實驗時應(yīng)該控制甲苯的使用質(zhì)量濃度為小于0.5 g/L。在厭氧操作箱中，先取上述經(jīng)過初培養(yǎng)的復(fù)合菌液，取清液并且過濾，濾掉油和雜質(zhì)，利用氣相色譜測定培養(yǎng)液中和培養(yǎng)瓶上層空氣中的甲苯的初始含量，由于清液過濾也可能含有極少量的石油烴，在后期培養(yǎng)時，測定的甲苯降解率只是相對值。再分別取0.5 g12C和13C標記的甲苯標準品，分別加入到1 L培養(yǎng)基中，再分裝為50 mL同時轉(zhuǎn)入到150 mL無菌培養(yǎng)瓶中，再加入50 mL的復(fù)合菌液，以加菌液滅菌和不加菌液為對照，分別做多組重復(fù)，每次測定取樣重復(fù)5次，培養(yǎng)60 d。所用選擇無機鹽培養(yǎng)基：KH2PO45.0 g；K2HPO45.0 g；NH4Cl 5.0 g；NaCl 1.0 g；MgCl22.0 g；CaCl20.1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g；硫酸亞鐵銨0.5 g；定容到1 L；pH值7.0～7.2。

1.4 SIP和DGGE分析方法

取12C和13C標記的甲苯處理培養(yǎng)液離心收集菌體（12 000 r/min，15 min），除去雜質(zhì)，用DNA提取試劑盒提取菌液DNA（Tiangen Biotech公司）［9］。再用等密度梯度離心法使DNA在氯化銫溶液中高速離心，達到分離的目的［10］。離心時氯化銫的初始密度為1.692 g/mL，并用手持折射儀矯正［11］。上述提取的DNA 2 mg和1.5 mL溴化乙啶（4 mg/mL，對DNA進行染色以便觀察）、200 mL CsCl TE緩沖溶液充分混合。然后再取0.2 mL混合液和4.8 mL的氯化銫TE緩沖溶液在5.1 mL的快封離心管中準備離心。離心參數(shù)為48 000 r/min，離心時間25 h，溫度4℃。離心結(jié)束后在離心管底部用針刺穿，然后以一定的流速通過蠕動泵在離心管頂部加入水，在頂部形成恒定的壓力，這樣底部的氯化銫溶液以恒定的速率流出，收集不同密度的氯化銫溶液，分裝。再用聚乙二醇除去氯化銫，回收DNA并用70%的乙醇沖洗，保存在4℃條件下備用［11］。上述離心得到的DNA經(jīng)16SrDNA基因的擴增，采用引物341F和534R，使用的PCR儀器為9700PCR［12］，所用程序為94℃5 min，55℃60 s，72℃1 min，一共進行35個循環(huán)，溫度為4℃。將擴增得到的16SrDNA進行DGGE分離，儀器為DCode System，所用變性劑質(zhì)量分數(shù)為30%～60%，在電壓20 V下電泳30 min，然后150 V下電泳8 h，溫度為60℃。然后切膠回收測序［13］，得到序列后在數(shù)據(jù)庫中比對，以確定相似菌種［14］。

1.5 石油烴的測定方法

采用紅外分光光度測油儀時，參照GB/T16488 -1996，首先將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，然后酸化到pH≤2，用CCl4洗滌3次，加入NaCl振蕩，靜置分層后，取下層萃取液加入含有Na2SO4的玻璃砂心漏斗中，并用真空泵抽濾；與此同時，對上層溶液在重復(fù)剛才的操作。然后將漏斗中的濾液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，CCl4定容。稀釋一定倍數(shù)以后，用紅外分光測油儀確定石油烴含量［15-16］。

1.6 甲苯的測定方法

每次取樣時對培養(yǎng)瓶中的溶液進行萃取，培養(yǎng)液加入CS2，然后常溫下進行水浴振蕩2 h，4℃保存過夜。用梨形漏斗收集下層有機相于三角瓶中，對上層水相繼續(xù)加入CS2振蕩10 min，重復(fù)3次，將三角瓶中的有機相溶液用無水硫酸鈉過濾并且進行減壓蒸發(fā)，用CS2定容。而后進行甲苯回收率的檢測，配成甲苯的0.5 g/L的溶液，振蕩溶解，然后稀釋若干濃度梯度，50℃過夜，按照上述萃取方法進行萃取，最后通過色譜檢測甲苯，計算回收率。用島津GC-2010氣相色譜儀測定甲苯含量。色譜柱為彈性石英毛細柱（50 m×0.2 mm×0.5 μm），檢測器FID溫度180℃、進樣口溫度150℃。先用甲苯標準溶液逐級稀釋，用色譜檢測，然后計算甲苯含量［17］。

1.7 氣相色譜和質(zhì)譜連用的測定方法

GC-MS分析。采用Agilent 6890N氣相色譜/ 5975i質(zhì)譜聯(lián)用儀。彈性石英毛細柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm）。進樣口溫度300℃，程序升溫初溫50℃進行1 min，以20℃/min的速度提升溫度到120℃，再以4℃/min的速度升溫到250℃，最后以3℃/min的速度升溫到310℃，維持30 min。質(zhì)譜EI源，70 eV，照射燈絲電流100 μA，進行全掃描［17-18］。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin8.0畫圖軟件，數(shù)據(jù)分析采用SPSS統(tǒng)計軟件，采用標準差（SD）和最低顯著性檢驗（LSD）比較和分析各組數(shù)據(jù)之間的差異。

2 結(jié)果分析

2.1 細菌降解石油烴的分析

通過油藏中的采出水富集培養(yǎng)石油烴降解菌，從表1可以看出，在培養(yǎng)初期50～200 d，石油烴降解率很低，到200 d時，達到4.1%。從250 d開始，石油烴降解率逐漸升高，并在各個測量時間點的時候差異顯著，最終在500 d時達到36.4%。直到400 d時開始有甲烷產(chǎn)生，為130.7 μmol；到500 d時，甲烷產(chǎn)量為201.2 μmol。

有研究［19］表明，甲烷是石油烴降解的終端產(chǎn)物。近年來有學者從油藏采出水中分離得到降解石油的菌群［20］。這些菌群中包含有專門降解芳香烴的菌群［21-22］，可以為降解石油提供豐富的菌源。從圖1和圖2（0～90 min）可以看出，飽和烴分布完整，且圖2中從左到右大部分的飽和烴都被降解，表明這種降解菌的降解效果很理想。

2.2 細菌降解甲苯的分析

圖3為12C和13C標記甲苯的降解情況?？梢钥闯黾妆降慕到饴孰S著培養(yǎng)天數(shù)的增加而顯著增加。其中13C標記的甲苯處理的甲苯降解率在60 d達到67%，而12C標記甲苯處理的甲苯降解率，在60 d達到69%，兩種標記處理的甲苯降解率差異不顯著。在培養(yǎng)瓶頂部空氣中也未檢出甲苯，說明甲苯?jīng)]有揮發(fā)，完好地溶解于培養(yǎng)液中。對照處理的甲苯降解率為0，說明甲苯的降解與培養(yǎng)基溶液無關(guān)。

圖3 12C和13C標記甲苯的降解Fig.3 Degradation situation of12C-toluene and13C-toluene

2.3 降解12C和13C標記甲苯的細菌群落分析

由于不同輕重同位素組成的化合物具有相同的物理化學性質(zhì)，所以細菌可以代謝它們來合成自身的物質(zhì)（如DNA核酸）。用13C標記的石油烴經(jīng)過微生物菌群的降解合成了自身的13C-DNA，通過在氯化銫溶液中高速離心，就可以把13C-DNA和12C-DNA分開［10］。重同位素取代輕同位素將導(dǎo)致其相對分子質(zhì)量增加，所以在離心的時候就呈現(xiàn)出分離，12C-DNA在上層，密度小，13C-DNA在下層，密度大［11］。本實驗經(jīng)過60 d的降解后提取菌液DNA，在離心后收集到1.64～1.73 g/mL DNA的氯化銫溶液，然后進行DGGE分析，結(jié)果見圖4和圖5。由圖4看出，細菌降解12C標記的甲苯時，在低密度中含有豐富的細菌群落，回收條帶多，而在高密度中沒有細菌群落，這與用普通的12C標記甲苯進行培養(yǎng)相符。這是因為經(jīng)過離心，13CDNA會在高密度中，12C-DNA會在低密度中。細菌降解13C標記的甲苯時，在高密度溶液中回收了大量條帶，而在低密度溶液中回收的條帶偏少。這是因為細菌降解了13C標記的甲苯，形成13C DNA在高密度溶液。所以在圖5中，從高密度梯度中切膠（如紅色箭頭標明）回收13C-DNA，然后進行測序用于后期分析鑒定降解甲苯的細菌。有研究表明，通過碳源標記的方法，可以鑒定出降解特定化合物的細菌群落［11］。

圖4 細菌降解12C和13C甲苯處理的DGGE電泳回收條帶數(shù)Fig.4 Bacterial degradation DGGE recovery bands of12C-toluene and13C-toluene treatments

圖5 細菌降解13C標記的甲苯處理的DGGE分析Fig.5 Bacterial degradation DGGE analysis of13C-toluene treatment

2.4 芳烴降解菌的鑒定分析

將高密度的13C DNA條帶回收送測序公司克隆測序，測出3株（a、b、c）該芳烴降解菌的序列，見表2。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，從中得知相似度92%是1株降解氯苯的細菌和1株柴油降解菌，相似度90%的是1株高效石油烴降解菌。從中得知，本實驗室培養(yǎng)的是高效石油烴降解菌，其中13C標記甲苯培養(yǎng)時，從重密度溶液中分離得到芳烴降解菌條帶，從而鑒別出了此芳烴降解菌的相似序列，可以在以后應(yīng)用此菌群進行石油降解和生物修復(fù)。

表2 芳烴降解菌的分析和鑒定Table 2 Analysis and identification of aromatic hydrocarbon degrading bacteria

3 結(jié) 論

（1）從油田采出水中富集培養(yǎng)復(fù)合的石油烴降解菌群，在500 d對石油烴降解率達到36.4%，并且在400 d開始產(chǎn)氣為130.7 μmol。

（2）以13C標記的甲苯為碳源和以12C標記的甲苯培養(yǎng)菌群，經(jīng)過60 d的培養(yǎng)，測得甲苯降解率分別為67%和69%。

（3）通過回收高密度的13C-DNA，進行測序發(fā)現(xiàn)有3株相似序列，其中有2種石油烴降解菌，還有1種為氯苯降解菌。

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（編輯 劉為清）

Identification of arene degradation bacteria using carbon isotope labeling method

HU Hengyu，ZHAO Dongfeng，LIU Chunshuang
（College of Chemical Engineering in China University of Petroleum，Qingdao 266580，China）

The degradation bacteria of petroleum hydrocarbon were enriched and cultured from the oilfield water.Using13C-toluene as carbon source and denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）technology to identify and investigate the bacterial community which could degrade the toluene.The results show that after 500 days anaerobic degradation the petroleum hydrocarbon degradation rate is 36.4%by complex bacterium，and the methane yield is 201.2 μmol.It is also found that after 60 days culture the carbon source13C-toluene degradation rate is 67%by the complex bacterium.Meanwhile，after 60 days culture the12C-toluene degradation rate is 69%，and two kinds of toluene degradation rate are not significantly different.13C-DNA is recovered and identified for three types of aromatic hydrocarbon degrading bacteria.

carbon isotope；bacteria identification；CsCl density gradient；DGGE analysis；arene

T 992.4

A

胡恒宇，趙東風，劉春爽.碳同位素標記法鑒別芳烴降解菌研究［J］.中國石油大學學報（自然科學版），2015，39（6）：57-62.

HU Hengyu，ZHAO Dongfeng，LIU Chunshuang.Identification of arene degradation bacteria using carbon isotope labeling method［J］.Journal of China University of Petroleum（Edition of Natural Science），2015，39（6）：57-62.

1673-5005（2015）06-0057-06

10.3969/j.issn.1673-5005.2015.06.007

2015-05-09

中國石油天然氣集團公司科學研究與技術(shù)開發(fā)項目（2008D-4704-2）

胡恒宇（1983-），男，博士研究生，研究方向為原油降解及資源化利用。E-mail：hhyu01@163.com。