蘇會玲 蘇紅慧 張培新 藺 強(qiáng) 陳 坤 劉風(fēng)玲

胃癌在我國是1種常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2010年全國胃癌新發(fā)病人數(shù)為404 565例、死亡287 851例，位列惡性腫瘤發(fā)病率的第2位、死亡率的第3位［1］。盡管目前隨著診療手段的進(jìn)步，早期胃癌的預(yù)后有了比較大的提高，但晚期胃癌的預(yù)后仍然較差，其5年生存率僅為 15%左右［2］。早在 1986年，Dovrak［3］就提出將腫瘤看做是“沒有治愈的創(chuàng)傷(wound that do not heal)”這一經(jīng)典理論，隨后大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)展與普通傷口愈合過程中有著驚人的相似性，其中血管生成及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。本研究通過對胃癌組織中低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、c-MET受體及 CD34 的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，進(jìn)一步分析HIF-1α和c-MET受體與胃癌各臨床病理特征及胃癌組織血管生成之間的關(guān)系，為判斷胃癌的預(yù)后及靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

按照患者術(shù)前檢查資料完善、手術(shù)記錄及術(shù)后病理資料完整、胃癌原發(fā)灶位于食管齒狀線以下至幽門部位及術(shù)前未行新輔助放化療的入組標(biāo)準(zhǔn)，除外胃部良性腫瘤、殘胃癌及既往患有其他惡性腫瘤的患者，最終本研究共收集華北石油總醫(yī)院普外科2003年9月1日至2008年8月18日之間行手術(shù)治療的74例患者的胃癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距癌灶2～5 cm)。74例患者的臨床病理特征見表1。其中，男性56例，平均年齡61歲;女性18例，平均年齡55歲;按腫瘤分化程度，高分化5例，中分化17例，低分化及未分化52例;按照AJCC第六版TNM分期，T18例，T28例，T348例，T410例;N023例，N123例，N221例，N37例;M065例，M19例;Ⅰ期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期26例，Ⅳ期25例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

免疫組化所需兔抗人HIF-1α、c-MET、原始造血細(xì)胞(CD34)單克隆抗體、山羊抗兔IgG/HRP多聚體及DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，其他試劑由華北石油總醫(yī)院病理科提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)SP法，蠟塊切成厚約4 μm放入60℃烘箱內(nèi)烤片過夜;脫蠟;抗原微波熱修復(fù);內(nèi)源性過氧化物酶滅活;滴加山羊血清封閉液;滴加兔抗人HIF-1α或兔抗人c-MET或兔抗人CD34單克隆抗體工作液，37℃孵育2 h;滴加山羊抗兔IgG/HRP多聚體，溫育30 min;滴加DAB顯色劑;蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 HIF-1α 和c-Met陽性的判定 HIF-1α 陽性染色為細(xì)胞核或胞質(zhì)呈黃色或棕黃色顆粒，c-Met陽性染色為細(xì)胞胞質(zhì)著色呈黃色或棕黃色顆粒。應(yīng)用Mattern積分法，即由染色陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評估。每例標(biāo)本選擇含有陽性細(xì)胞的5個高倍鏡視野(×400)，并計(jì)數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，最后取其平均值作為陽性細(xì)胞百分率，0分:陽性細(xì)胞率為=0%，1分:陽性細(xì)胞≤10%，2分:陽性細(xì)胞率≤50%，3分:陽性細(xì)胞率＞50%;染色強(qiáng)度評估，0分:陰性，1分:淺黃色，2分:深黃色，3分:棕黃色。最終將上述兩項(xiàng)相加，總分≤1視為HIF-1α或c-Met陰性表達(dá)，總分≥2判定為陽性表達(dá)。

1.4.2 MVD的判定 采用 Weidner法判斷陽性結(jié)果，在腫瘤組織內(nèi)，被CD34染成棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，與其相鄰的腫瘤細(xì)胞、微血管及其他結(jié)締組織分開，可視為一個血管計(jì)數(shù)。在低倍鏡下(×100)尋找腫瘤組織中血管密度最高的區(qū)域，隨后在高倍鏡下(×400)選取5個血管最高密度區(qū)的微血管數(shù)，取均值代表MVD，但染色不清楚、管壁有纖維組織及肌層的存在、管腔直徑＞8個紅細(xì)胞以及伴有壞死或炎癥的微血管均不計(jì)入總數(shù)。

以上均由病理科兩名醫(yī)師采用單盲法進(jìn)行閱片。

1.5 隨訪

所有患者隨訪日期自手術(shù)日起至2014年12月31日。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，HIF-1α、c-Met受體與各臨床病理參數(shù)之間采用χ2檢驗(yàn);兩變量相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)進(jìn)行分析，生存分析采用Kaplan-Meier分析，并用Log-rank法檢驗(yàn)。以上均以P＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織中HIF-1α及c-Met的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，HIF-1α陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，部分胞質(zhì)中也可見陽性表達(dá)。c-Met陽性表達(dá)主要位于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。免疫組化結(jié)果證實(shí)胃癌組織中HIF-1α陽性表達(dá)率為74.3%(55/74)，癌旁組織中其陽性表達(dá)率為12.2%(9/74)，二者比較具有顯著差異(P＜0.05);胃癌組織c-Met陽性表達(dá)率為66.2%(49/74)，而癌旁組織其陽性表達(dá)率為21.6%(16/74)，二者比較差異顯著(P＜0.05)。

2.2 胃癌組織中HIF-1α和c-Met的表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

HIF-1α在胃癌患者癌組織中的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分期具有顯著相關(guān)性(P＜0.05);而c-Met受體的表達(dá)受腫瘤分化程度、浸潤深度及分期的影響(P＜0.05)，見表1。

表1 HIF-1α、c-Met表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.3 胃癌組織中HIF-1α表達(dá)與c-Met的關(guān)系

74例胃癌患者中，HIF-1α與c-Met的表達(dá)同為陽性者42例，同為陰性者12例，兩者的表達(dá)呈顯著相關(guān)性(γ =0.365，P＜0.05)。

2.4 胃癌組織中HIF-1α、c-Met表達(dá)與MVD的關(guān)系

CD34陽性表達(dá)的管腔樣結(jié)構(gòu)為胃癌微血管。HIF-1α陽性表達(dá)的胃癌組織 MVD為(45.22±14.65)，較 HIF-1α陰性表達(dá)組的顯著升高(P＜0.05);c-Met陽性表達(dá)的胃癌組織MVD為(45.33±14.23)，也高于 c-Met陰性組的(P＜0.05)，見表2。

表2 HIF-1α及c-Met的表達(dá)與胃癌MVD的關(guān)系

2.5 HIF-1α及c-Met的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

截至2014年12月31日，74例患者中62例死于胃癌，入組患者的中位生存時間為20.0個月。應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并經(jīng) Log-rank檢驗(yàn)，HIF-1α陽性表達(dá)患者的生存時間顯著短于陰性表達(dá)患者(P＜0.05)，c-Met陽性表達(dá)患者生存時間也顯著短于陰性表達(dá)患者(P＜0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HIF-1α和c-Met共表達(dá)患者的中位生存時間僅有14.0個月，較非共表達(dá)組患者的生存時間顯著縮短(P＜0.05)，見圖1。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的快速增殖及腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能的異常降低了實(shí)體瘤內(nèi)部的血液供應(yīng)［4］。目前，越來越多的研究證實(shí)原發(fā)腫瘤的低氧微環(huán)境與腫瘤的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)［5-6］。腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)低氧微環(huán)境可以使HIF1、HIF2的表達(dá)上調(diào)［7］，而低氧微環(huán)境和HIF可以進(jìn)一步引起其他基因的轉(zhuǎn)錄從而影響腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞代謝、侵襲等生理過程［8］。

圖1 胃癌中HIF-1α、c-Met的表達(dá)與生存時間的關(guān)系

Chen等［9］對446例經(jīng)手術(shù)治療的胃癌患者的病理標(biāo)本行免疫組化研究，結(jié)果顯示HIF-1α的強(qiáng)陽性表達(dá)率為48.7%，進(jìn)一步分析顯示HIF-1α在肝轉(zhuǎn)移及腹腔轉(zhuǎn)移的胃癌患者中表達(dá)顯著升高，HIF-1α強(qiáng)陽性表達(dá)患者的PFS及OS顯著縮短 。Chen等［10］對HIF-1α與胃癌臨床病理特征及預(yù)后進(jìn)行了Meta分析，結(jié)果顯示HIF-1α的表達(dá)與胃癌組織的分化程度、侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)(P＜0.05)，HIF-1α高表達(dá)胃癌患者的5年生存率顯著低于低表達(dá)組(Rr=1.508，95%CI:1.318～1.725，P=0.001)。本研究顯示 HIF-1α 在胃癌組織中的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分期具有顯著相關(guān)性，并且HIF-1α陽性表達(dá)的胃癌患者生存時間顯著縮短，這與前述的研究結(jié)果基本相一致，提示HIF-1α在胃癌的發(fā)生及疾病進(jìn)展中有一定的意義。

Peng等［11］共納入14項(xiàng)研究2258例胃癌患者的Meta分析顯示c-Met高表達(dá)胃癌患者的生存時間顯著縮短(Hr=2.57，95%CI:1.97～3.35，P=0.013)，而Yu等［12］納入15項(xiàng)研究2210例胃癌患者的Meta分析與 Peng的研究結(jié)果相似(Hr=2.112，95%CI:1.622～2.748，P=0.007)。本實(shí)驗(yàn)顯示 c-Met受體的表達(dá)與胃癌組織的分化程度、浸潤深度及分期顯著相關(guān)，c-Met陽性表達(dá)患者的預(yù)后不佳，這與Peng和Yu的研究相一致，提示c-Met可以作為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

目前研究證實(shí)低氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖主要依靠兩種機(jī)制。首先，低氧條件對正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞均會產(chǎn)生毒性，某些細(xì)胞內(nèi)部通過基因突變在此極端環(huán)境下存活［13］;其次，低氧激活腫瘤血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等相關(guān)信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究顯示，HIF-1α與c-Met的表達(dá)顯著相關(guān)，并且HIF-1α及c-Met陽性表達(dá)的胃癌組織中MVD顯著增高，提示HIF-1α、c-Met參與胃癌腫瘤微環(huán)境中血管的生成;進(jìn)一步的生存分析顯示HIF-1α和c-Met共表達(dá)患者的生存時間顯著縮短，這可能與低氧條件刺激腫瘤血管生成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移等過程相關(guān)。Pennacchietti等［14］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)腫瘤組織內(nèi)低氧區(qū)域存在c-Met受體的表達(dá)，HIF-1可以誘導(dǎo)c-Met原癌基因的激活。Corso等［15］的實(shí)驗(yàn)顯示沉默腫瘤細(xì)胞中的c-Met的表達(dá)可顯著降低腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲性。Matsumura等［16］的研究發(fā)現(xiàn) HIF-1α上調(diào) c-Met的表達(dá)可以進(jìn)一步激活PI3K/Akt、MAPK、STAT3等下游信號通路基調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，靶向HGF/c Met信號通路可以抑制腫瘤血管的生成。

隨著腫瘤微環(huán)境領(lǐng)域研究的深入以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的興起，腫瘤抗血管生成治療以逐漸進(jìn)入臨床。Ramucirumab是靶向VEGFR2的單克隆抗體，可以抑制腫瘤血管的生成，隨著REGARD臨床試驗(yàn)［17］結(jié)果的公布，2014年4月FDA批準(zhǔn)了Ramucirumab單藥應(yīng)用于晚期胃癌，這為胃癌患者帶來了新的希望。相信隨著對HIF-1α及c-Met信號通路的系統(tǒng)研究及相關(guān)靶向藥物的問世，高選擇性的靶向藥物能夠延長HIF-1α或c-Met陽性表達(dá)胃癌患者的生存時間，為胃癌患者的個體化治療提供更加有效的藥物。

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