孫丹丹，宋守欣，王紅霞

（功能材料的設計合成與綠色催化黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱師范大學化學化工學院，黑龍江哈爾濱150025）

Cu2+修飾低固載量固定化漆酶的活性研究*

孫丹丹，宋守欣，王紅霞

（功能材料的設計合成與綠色催化黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱師范大學化學化工學院，黑龍江哈爾濱150025）

由于漆酶這種生物蛋白酶有容易變性失活且不可重復使用的特性,限制了漆酶的應用和發(fā)展。因此如何提高漆酶的活性，穩(wěn)定性以及重復使用性尤為重要。本文采用交叉偶聯(lián)技術,將漆酶固定在具有核殼結構的磁性納米粒子Fe3O4/SiO2上,并研究了用Cu2+修飾后的低固載量固定化漆酶的活性變化以及修飾后固定化漆酶的穩(wěn)定性。實驗結果顯示：Cu2+修飾后的低固載量固定化漆酶的相對活性提高了54%；而且在溫度不太高的情況下，修飾后的低固載量固定化漆酶的相對活性優(yōu)于修飾前的固定化漆酶；修飾后的固定化漆酶降解濃度為10mg·L-1的普施安染料，重復利用13次后降解率仍然可以達到92%。

固定化漆酶；銅離子；活性；穩(wěn)定性

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它能催化大量的酚類和芳香胺類化合物[1]。游離的漆酶不易回收利用，且穩(wěn)定性較低，容易變性失活，而酶固定化技術能夠實現(xiàn)漆酶的重復使用并改善其穩(wěn)定性，所以漆酶的固定化研究引起了人們的廣泛關注，而固定化漆酶的載體的選擇就變得至關重要[2]。由于磁性載體固定化酶在磁場作用下可從反應體系中迅速分離，有利于回收和反復使用、降低成本的特點[3-5]，近年來，用磁性載體在漆酶固定化技術中越來越受到重視。Jun Ge[6]等人發(fā)現(xiàn)將含有Cu2+的無機物與有機物混合，通過相互作用形成尺寸不一樣大的具有花瓣形狀的納米花，這種含銅的納米花漆酶與游離漆酶相比催化活性和穩(wěn)定性都有所提高。本課題組以戊二醛為交聯(lián)劑，將漆酶穩(wěn)定固載到氨基修飾的磁性載體Fe3O4/SiO2納米粒子上，進行固定化漆酶對酚類偶氮染料的降解研究，研究發(fā)現(xiàn)，在不使用氧化還原介體的情況下，這種固定化漆酶在1h內(nèi)對偶氮染料的脫色率達80%以上并且重復利用10次后脫色率仍能達到80%左右[3]。本實驗在此基礎上，用120mM的Cu2+對以Fe3O4/SiO2為載體的固定化漆酶進行修飾，考察當載體質(zhì)量為50mg，低固載量時（26mg·g-1）固定化漆酶相對活性的變化，并對修飾后固定化漆酶的穩(wěn)定性進行研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

FeCl2·4H2O；FeCl·36H2O；正硅酸乙酯（TEOS）；異丙醇；漆酶（Sigma-Aldrich）；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS）；戊二醛（天津市科密歐化學試劑中心）。普施安（PR，Sigma-Aldrich）；HAc。

Lambda45型紫外分光光度計（美國PerkinElmer公司）；JSM-6610型掃描電鏡。

1.2 固定化漆酶制備

本實驗是取質(zhì)量為50mg的Fe3O4/SiO2載體溶解在乙醇中，超聲10min，加入APS，將兩溶液混合在一起，靜置40min，將混合物在室溫下攪拌12h，反應結束后用蒸餾水洗滌除去未反應的APS。磁性分離后得到氨基修飾的磁性SiO2粒子，標記為Fe3O4/SiO2-NH2。

向處理完的載體中加入2.5%戊二醛，25℃下攪拌3h，得到交聯(lián)的復合粒子，標記為Fe3O4/SiO2-NH2-GA，用PBS洗滌數(shù)遍，然后向載體中加入濃度為0.2mg·mL-1的漆酶溶液，室溫攪拌12h,過量的漆酶用磷酸緩沖液洗滌直至用ABTS檢測不到殘留的漆酶，由此得到固定化漆酶，標記為Fe3O4/SiO2-NH2-GA-E，保存在PBS中，放入4℃的冰箱中，備用。

1.3 固定化漆酶的修飾

將固定化漆酶從冰箱中取出，磁分，將上清液倒入水槽中，加入10mLPBS溶液，取濃度為100，120，140mM的CuSO4溶液各4mL分別加入上述體系中，得到修飾后的固定化漆酶，連續(xù)測試6d。

1.4Cu2+修飾后固定化漆酶相對活性的測定

酶活力（enzymeactivity）也稱酶活性，是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學反應的速度來表示，酶催化反應速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。反應在25℃下進行，在總反應體積8mL中，含有2mL1mmol ABTS，6mLHAc緩沖液（pH=5.0）。添加到固定化漆酶溶液中啟動反應,5min后在波長為420 nm下測定其吸光度值的變化[2,7]相對酶活的計算公式：

R=Ai/Af×100%

式中Ai：固定化漆酶的初始活性；Af：加入Cu2+后固定化漆酶的活性。兩者相比，以Ai初始活性為100%則結果就是加入Cu2+后對活性影響的一個相對值變化。

1.5 固定化漆酶修飾前后操作穩(wěn)定性研究

為考察Cu2+修飾后的固定化漆酶的操作穩(wěn)定性，本實驗取6份相同的固定化漆酶，固載量均為26mg·g-1，3份用120mMCu2+修飾，3份用于對比實驗，在最適溫度下用于固定化漆酶降解偶氮染料普施安重復利用的平行實驗。取修飾前后的固定化漆酶，用PBS溶液洗1～2遍，除去殘留的Cu2+，最后將洗液倒掉，取濃度10mg·L-1的普施安染料15mL，15mLPBS溶液加入到固定化漆酶的燒杯中攪拌，每隔20min用紫外分光光度計測量吸光度的變化。

普施安脫色率根據(jù)Lambert-Beer定律計算：

式中C0、C、A0、A分別表示PR溶液的初始濃度、脫色后濃度、初始吸光度、脫色后的吸光度。

1.6 固定化漆酶修飾前后熱穩(wěn)定性的研究

載體質(zhì)量為50mg的固定化漆酶與修飾后的固定化漆酶，測試溫度從20℃到70℃。在不同溫度下放置30min測定漆酶的吸光度變化值然后根據(jù)公式（1.4）來計算固定化漆酶的相對活性，以在室溫時的相對活性為100%。

2 結果與討論

2.1Cu2+修飾后固定化漆酶相對活性的影響

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,對于漆酶來源不同，銅的含量也不同，一般含有4個Cu2+，目前，已證實Cu2+是漆酶的活性部位[8，9]，所以Cu2+的加入是否會對漆酶活性有進一步的提高呢？本實驗用不同Cu2+濃度對固定化漆酶進行修飾，然后對其活性進行測試，結果顯示固定化漆酶的相對活性有明顯提高。

圖1 是在漆酶固載量為26mg·g-1時不同Cu2+濃度對固定化漆酶活性的影響。

圖1 Cu濃度對固定化漆酶相對活性的影響（Cinitial laccase=0.2mg·mL-1）Fig.1Effect of Cu2+concentration on the relative activity of immobilized laccase

從圖1中可以看到，當Cu2+濃度為120mM時對漆酶活性影響最大[6]，相對活性可以達到154%。

2.2 Cu2+修飾后固定化漆酶的穩(wěn)定性研究

2.2 .1 固定化漆酶的熱穩(wěn)定性研究漆酶是一種蛋白酶，在較高溫度時不可避免發(fā)生失活行為，漆酶的熱穩(wěn)定性差已經(jīng)成為限制其在較高溫度下發(fā)展應用的重要瓶頸，因此，研究漆酶的熱穩(wěn)定性及如何提高漆酶的熱穩(wěn)定性具有極為重要的意義。圖2是在不同溫度下對修飾前后的固定化漆酶進行熱處理，得到不同溫度下相對活性的曲線。

圖2 溫度對Cu2+修飾前后的固定化漆酶相對活性的影響（pH=7.0磷酸緩沖溶液）Fig.2Effect of temperature on the relative activity of the immobilized laccase before and after modification with Cu2+in the phosphate buffer at pH=7.0

從圖2中可以看到，25℃時為固定化漆酶的最適溫度，將最適溫度下的活性定義為100%。而且隨著溫度的升高，修飾前后的固定化漆酶相對活性都呈現(xiàn)下降的趨勢。當溫度達到50℃以上時，Cu2+修飾后的固定化漆酶的相對活性下降較快，70℃時的相對活性達到60%左右[10]。而在25～45℃之間，Cu2+修飾后的固定化漆酶的相對活性下降較慢，而且活性高于修飾前活性。由此說明，Cu2+修飾后的固定化漆酶在溫度不太高的情況下，能夠保持較高的活性。

2.2.2Cu2+修飾后固定化漆酶的操作穩(wěn)定性研究

圖3 Cu2+修飾后固定化漆酶操作穩(wěn)定性（10mg·L-1PR，pH=7.0 25℃）Fig.3Repeated use of immobilized laccase before and after Cu2+modification for the decoloration of 10mg·L-1of PR solution at 25℃in the phosphate buffer solution

從圖3中可以看出，未用Cu2+修飾的固定化漆酶降解第一份10mg·L-1普施安之后，殘留濃度最小大概在0.5%左右，隨著使用次數(shù)的不斷增多，10 mg·L-1的普施安的殘留濃度逐漸增大，第13個循環(huán)時達到14%。而用銅離子修飾后的固定化漆酶在重復使用13次之后，普施安的殘留濃度更低，只有8%左右，可見，修飾后的固定化漆酶在經(jīng)過多次循環(huán)使用后，操作穩(wěn)定性要優(yōu)于未經(jīng)Cu2+修飾的固定化漆酶，在第13個循環(huán)時降解率仍能達到92%。

2.3Cu2+修飾后固定化漆酶的SEM分析

圖4120mM Cu2+修飾固定化漆酶的SEM圖，修飾（a）1d（b）3d（c）5dFig.4SEM micrographs of immobilized laccase modified with 120mM Cu2+for（a）1 day（b）3 days and（c）5 days

圖4 是120mM Cu2+修飾固定化漆酶SEM照片，（a）為修飾1d的形貌，我們可以看到固定化漆酶成層疊狀，一些片狀結構隱約可見。修飾3d時，已經(jīng)初步有花狀形成，片狀結構越來越多，越緊密，越來越立體。修飾5d時，我們可以清晰的看到納米花結構的形成。在JunGe[6]的文獻中，他們也報道了銅離子修飾后的固定化漆酶呈現(xiàn)納米花的機構，我們這里的結果和他們一致而且對照修飾后的固定化漆酶活性數(shù)據(jù)，固定化漆酶是在銅離子修飾5d時活性最高。Jun Ge等人認為相對較高的活性與漆酶這種納米花結構有關，漆酶的比表面積增大，吸附能力增加，導致漆酶對底物的脫色能力增強[6]。我們推斷固定化漆酶活性提高與漆酶的形貌變化有關，但不完全是漆酶形貌變化導致比表面積增加的原因，因為這種染料是無法被游離漆酶降解的，所以單純的漆酶比表面增加無法使該偶氮染料降解，恰恰是在漆酶固載在Fe3O4/SiO2載體上[3]，才能使這種染料得到快速降解，因此Cu2+的加入很有可能改變或誘導漆酶的活性位發(fā)生變化，確切的原因將做進一步的研究。

3 結論

本文對低固載量的固定化漆酶進行Cu2+修飾，實驗結果顯示：120mMCu2+的修飾低固載量（26mg· g-1）的固定化漆酶，漆酶的活性有明顯提高，提高了54%。因此，可以利用這一方法制備低固載量的漆酶，獲得較高的活性。修飾后的固定化漆酶的熱穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性研究結果表明：Cu2+修飾后的固定化漆酶，在溫度不太高的情況下，其相對活性優(yōu)于Cu2+修飾前的固定化漆酶；修飾后的固定化漆酶，降解10mg·L-1的普施安染料，重復利用13次后降解率仍然可以達到92%，穩(wěn)定性優(yōu)于Cu2+修飾前的固定化漆酶。

［1］Silvia Tilli,Ilaria Ciullini,Andrea Scozzafava,FabrizioBriganti.Differential decolorization oftextile dyes in mixtures and the joint effect of laccase and cellobiose dehydrogenase activities present in extracellular extracts from Funalia trogii［J］.Enzyme and Microbial Technology,2011，49:465-471.

［2］Jianbo Guo,Huijuan Liu Jiuhui Qu,et al.The structure activity relationship ofnon-dissolved redoxmediators duringazodye bio-decolorizationprocesses［J］.BioresourceTechnology，2012，112：350-354.

［3］Hongxia Wang,Wei Zhang,Jingxiang Zhao,Lulu Xu,Chunyan Zhou,Lin Chang.Rapid Decolorization of Phenolic Azo Dyes by Immobilized Laccase with Fe3O4/SiO2Nanoparticles as Support［J］. Ind.Eng.Chem.Res.,2013,52（12）:4401-4407.

［4］Brandi P,D'Annibale A,Galli C,et al.In Search for Practical Advantages from the Immobilisation of an Enzyme:The Case of Laccase［J］.J.Mol.Catal.B:Enzym.,2006,41（1/2）:61-69.

［5］薛方亮，張雁秋.染料廢水處理技術最新研究進展［J］.水科學與工程技術,2007,（2）:26-29

［6］Jun Ge,JianduLei,and Richard N.Zare.Protein inorganic hybrid nano owers［J］.NATURENANOTECHNOLOGY.2012，（7）:428-432.

［7］Bourbonnais,R.;Leech,D.;Paice,M.G.Electrochemical analysis of the interactions of laccase mediators with lignin model compounds［J］.Biochim.Biophys.Acta:Gen.Subj.,1998,1379（3）:381-390.

［8］Farrukh Jamal,Tabish Qidwai,Prabhash K.Pandey,Ranjan Singh, SangramSingh.Azoand anthraquinone dye decolorization in relation toits molecular structure usingsoluble Trichosanthes dioica peroxidase supplemented with redox mediator［J］.Catalysis Communications 2011,（12）:1218-1223

［9］H.Claus.Laccases:structure，reactions，distribution.Micron.2004，35：93-96.

［10］徐璐璐，魏冬雪，王紅霞.漆酶在Fe3O4SiO2表面的固定化及其性質(zhì)研究［J］.哈爾濱師范大學自然科學學報,2011,27（4）: 75-79.

Research on activity of immobilized laccase with lower laccase loading after Cu2+modification*

SUN Dan-dan，SONG Shou-xin，WANG Hong-xia
（Key Laboratory of Heilongjiang Province for Design and Synthesis of Functional Materials and Green Catalytic,College of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Normal University,Harbin 150025，China）

Laccase is a kind of biological protease,however,the easy denaturation and difficult separation for reuse limit the application and development of laccase.So,how to improve the activity stability of laccase and repeatability is particularly important.In this paper,laccase was immobilized on magnetic Fe3O4/SiO2nanoparticles through cross-coupling method to further investigate the modification of immobilized laccase with lower laccase loading by Cu2+and the corresponding activity as well as the stability of immobilized laccase after modification with Cu2+ions.The results show that the relative activity of the immobilized laccase with lower laccase loading after Cu2+modification increased by 54%,and the relative activity at lower temperature was better than that before modification with Cu2+ions;The modified immobilized laccase can be reused for the degradation of the procion dyes solution with a concentration of 10mg·L-1.,even 13 cycles later,the decolorization percentage is still up to 92%.

immobilized laccase；copper ions；active；stability

Q814.9

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150314

2015-01-13

黑龍江省自然科學基金（No.B201011）

孫丹丹（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：催化化學。

導師簡介：王紅霞（1974-），女，教授，博士，碩士研究生導師，主要從事多孔材料、Fe3O4/SiO2基負載型催化劑的設計、制備及甲烷轉化、有機污染物的去除等催化反應的研究。