王玥，趙偉，辛中帥，張同存，羅學(xué)剛*

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2. 正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇 南京 210023；3. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

蛋白質(zhì)多肽類藥物的脂肪酸修飾研究進(jìn)展

王玥1，趙偉2，辛中帥3，張同存1，羅學(xué)剛1*

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2. 正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇 南京 210023；3. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)多肽藥物的應(yīng)用越來越受到人們的青睞。但此類藥物具有血漿半衰期較短、免疫原性較強(qiáng)等不足之處，在很大程度上限制了其臨床應(yīng)用。因此，研究人員嘗試采用各種化學(xué)方法對蛋白質(zhì)多肽類藥物加以修飾，以彌補(bǔ)這一不足。與PEG修飾、糖基化修飾、定點(diǎn)突變等方法相比，脂肪酸修飾除了可獲得良好的生物活性、提高穩(wěn)定性、降低免疫原性外，更重要的是由于脂肪酸是構(gòu)成人體脂肪、類脂和細(xì)胞膜磷脂的重要成分，可有助于提高藥物的脂溶性，增大腸道黏膜透過性，增強(qiáng)藥物與受體的結(jié)合。對蛋白質(zhì)多肽藥物的脂肪酸修飾研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

蛋白質(zhì)多肽類藥物；脂肪酸；修飾

隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，蛋白質(zhì)多肽類藥物不斷涌現(xiàn)，已成為21世紀(jì)醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域中最活躍、進(jìn)展最快的藥物之一。蛋白質(zhì)多肽類藥物比化學(xué)藥物更接近于機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)，具有毒副作用小、不易蓄積導(dǎo)致中毒、療效穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于癌癥、心血管疾病、自身免疫疾病等疾病的治療，備受國內(nèi)外藥物開發(fā)商和研究者的青睞［1-2］。然而，蛋白質(zhì)多肽藥物仍在臨床應(yīng)用上存在瓶頸：不能直接口服給藥，需皮下給藥或肌注，在體內(nèi)不穩(wěn)定、易被蛋白酶降解、具有較高免疫原性從而容易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別，造成其半衰期普遍較短而必須加大給藥頻率和劑量，使病人的依從性大幅度降低［3-4］。為克服上述問題，研究人員嘗試采用各種化學(xué)方法對蛋白質(zhì)多肽類藥物加以修飾，通過修飾可顯著改善蛋白多肽類藥物的性狀，提高藥物的生物利用度、延長其在血漿中的半衰期，從而降低用藥劑量，減少用藥頻率。有關(guān)蛋白多肽類藥物的化學(xué)修飾在很多年前就已經(jīng)開始研究，已經(jīng)成功應(yīng)用的修飾方法包括PEG修飾、糖基化修飾和定點(diǎn)突變等等。近年來脂肪酸修飾、Fc片段融合以及白蛋白融合等新一代修飾方案也已有上市產(chǎn)品。本文就蛋白多肽類藥物的脂肪酸修飾方法、特點(diǎn)以及藥物研發(fā)情況進(jìn)行綜述。

1 蛋白質(zhì)多肽類藥物的化學(xué)修飾位點(diǎn)

根據(jù)不同的需要，蛋白質(zhì)多肽類分子側(cè)鏈或末端的自由氨基、羧基、巰基、酚羥基、咪唑基、胍基、吲哚基、甲硫基等均可選擇作為化學(xué)修飾的位點(diǎn)。其中，由于蛋白質(zhì)多肽側(cè)鏈裸露的氨基自由度較大、親核反應(yīng)活性較高，氨基通常被選擇作為蛋白質(zhì)多肽側(cè)鏈化學(xué)修飾的主要基團(tuán)［5］。

胰島素是最早應(yīng)用于臨床的蛋白類激素藥物，多年以來，研究者不斷致力于研發(fā)更加長效的胰島素類似物，以減緩病人的生理痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此胰島素也是最常被用于化學(xué)修飾研究的蛋白質(zhì)多肽類藥物的典型代表。基于對胰島素結(jié)構(gòu)的綜合研究，一般將胰島素分子中3個(gè)裸露的氨基，即GlyA1、PheB1的α-氨基和LysB29的ε-氨基，作為胰島素化學(xué)修飾的主要位點(diǎn)。其中，非質(zhì)子化的賴氨酸的ε-氨基是蛋白質(zhì)分子中親核反應(yīng)活性很高的基團(tuán)［6］。在非保護(hù)條件下對這些位點(diǎn)的修飾通?？赡艿玫絾涡揎?、二修飾及三修飾的混合物。由于不同氨基酸的pKa值不同，通過調(diào)節(jié)pH值可以控制修飾位點(diǎn)的選擇性和修飾度。在胰島素分子中，GlyA1的pKa值為8.0，PheB1的pKa值為6.7，LysB29的pKa值為10.53。一般來說，在pH值為5～6時(shí)，單?；饕l(fā)生在PheB1上，二?；a(chǎn)物主要是A1，B1-?；?；pH值為6.8～9.2時(shí)單酰化主要發(fā)生在GlyA1，同時(shí)二?；a(chǎn)物可能是B1，A1-或A1，B29-酰化物；當(dāng)pH值大于10時(shí)，單?；饕l(fā)生在LysB29的ε-氨基，其次可能的位點(diǎn)為GlyA1的α-NH2［7-8］。此外，溫度和反應(yīng)介質(zhì)也是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、活性和修飾程度的一個(gè)重要因素。

2 蛋白質(zhì)多肽類藥物結(jié)構(gòu)修飾的手段

結(jié)構(gòu)修飾是延長蛋白質(zhì)多肽類分子半衰期、實(shí)現(xiàn)長效化的重要技術(shù)手段之一。利用合適的修飾方法和修飾劑對蛋白質(zhì)多肽類藥物的主鏈結(jié)構(gòu)或?qū)?cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，可改變其分子大小、電荷和受體結(jié)合能力，提高脂溶性，同時(shí)通過修飾基團(tuán)形成的空間位阻保護(hù)易受蛋白水解酶進(jìn)攻的區(qū)域，延緩活性蛋白的降解，提高藥物的藥動學(xué)穩(wěn)定性［9］。

2.1 定點(diǎn)突變

將蛋白質(zhì)多肽分子中不穩(wěn)定的氨基酸殘基定點(diǎn)突變成穩(wěn)定的殘基，可以增加藥物的穩(wěn)定性及生物活性。人胰高血糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）的體內(nèi)半衰期僅2 min［10］。而與GLP-1同源性93%、8位和35位被氨基異丁酸取代的他司魯肽（taspoglutide）、與GLP-1同源性53%的exendin-4以及在exendin-4的C端添加Lys殘基的利西拉肽（lixisenatide，VE0010）等，則不僅能夠激動GLP-1受體，且因位點(diǎn)突變能夠抵抗體內(nèi)二肽基肽酶- 4（dipeptidyl peptidase-4，DPP- 4）降解，半衰期均顯著延長。其中，exendin-4（exenatide，艾塞那肽，商品名：Byetta /百泌達(dá)）已在2005年成為第一個(gè)獲FDA批準(zhǔn)用于治療Ⅱ型糖尿病的GLP-1受體激動劑［11-14］。

2.2 聚乙二醇修飾

聚乙二醇（polyethyleneglyeol，PEG）類修飾劑具有可體內(nèi)降解、無毒性、無抗原性、高度的親水性及水溶性、能與多種有機(jī)物組分相容等優(yōu)點(diǎn)，是目前最為常用的修飾劑。PEG修飾可抑制免疫反應(yīng)發(fā)生、阻礙蛋白酶降解，最終使藥物緩慢釋放、半衰期延長、血藥濃度波動減小。此外，PEG可以將它的親水性、柔性、抗凝血性等優(yōu)良性質(zhì)賦予到修飾后的蛋白質(zhì)多肽分子上。因此，已有不少PEG修飾的蛋白質(zhì)多肽類藥物上市，如PEG修飾的干擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子、天冬酰胺酶等［15-16］。然而，PEG在進(jìn)行多位點(diǎn)修飾時(shí)，非定點(diǎn)修飾具有隨機(jī)性，專一性差，定點(diǎn)修飾則由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜而不易控制條件，甚至可能造成生物學(xué)活性降低。因此，建立PEG修飾最優(yōu)方案依然是研究者們的一大難題。

2.3 糖基化修飾

糖基化修飾是指將寡糖結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)多肽分子中某些特殊功能團(tuán)以共價(jià)鍵相連接，包括N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化以及糖基磷脂酰肌醇修飾等［17］。糖基化修飾可增加空間位阻、提高蛋白質(zhì)水溶性和穩(wěn)定性、減少腎小球?yàn)V過，從而影響蛋白質(zhì)多肽類藥物的藥動學(xué)特性、生物學(xué)活性、免疫原性和凝聚性等［18］。Huet等［19］用戊糖載體（carrier pentasaccharide，CP）對恩夫韋肽T-20進(jìn)行修飾，再用PEG連接構(gòu)成恩夫韋肽-PEG（12）-CP，修飾后大鼠血漿半衰期從2.8 h延長至10 h以上，由此預(yù)測人體注射給藥頻率可由原來的每天2次減為每周1次，半衰期可達(dá)120 h。此外，促紅細(xì)胞生成素（EPO）經(jīng)過額外增加2個(gè)N糖基化修飾后所得到的Aranesp，半衰期延長了3倍，目前也已獲批上市［20］。

2.4 脂肪酸修飾

脂肪酸修飾分為不飽和脂肪酸修飾和飽和脂肪酸修飾。不飽和脂肪酸修飾主要是以油酸、亞油酸等進(jìn)行修飾，目前研究還相對較少。已有一些利用飽和脂肪酸進(jìn)行修飾且獲批上市用于臨床的藥物。飽和脂肪酸修飾主要是以肉豆蔻酸（myristic acid）、棕櫚酸（palmitic acid）進(jìn)行修飾。肉豆蔻酸，又名十四烷酸，是一種不溶于水，易溶于乙醇和乙醚的飽和脂肪酸，由椰子油的脂肪酸經(jīng)分餾而制得。棕櫚酸，又名十六烷酸、軟脂酸，以甘油脂的形式廣泛存在于動植物油脂中。與其他化學(xué)修飾類似，脂肪酸修飾可有效延長蛋白質(zhì)多肽類藥物的體內(nèi)半衰期。例如，以棕櫚酸修飾的exendin-4（Ex4-C16）給ICR小鼠皮下注射，其可在小鼠體內(nèi)存在長達(dá)10 d之久，而未修飾的exendin-4（Ex4）則在2 d左右被清除［21］。此外，與其他修飾劑相比，脂肪酸是構(gòu)成細(xì)胞膜磷脂及人體脂肪與類脂的重要成分，直接參與了細(xì)胞膜的組成以及蛋白質(zhì)配體與膜受體的結(jié)合，因此脂肪酸修飾更有助于提高藥物的脂溶性、腸道黏膜透過性及吸收效率，故而用脂肪酸修飾蛋白質(zhì)多肽類藥物越來越受到研究人員的關(guān)注。

3 脂肪酸修飾對蛋白質(zhì)多肽類藥物的影響

3.1 提高脂溶性與吸收

脂肪酸是細(xì)胞膜磷脂的重要成分，能維持細(xì)胞膜的流動性并參與細(xì)胞膜組裝，同時(shí)也是構(gòu)成人體脂肪和類脂的基本物質(zhì)。因此，脂肪酸修飾的蛋白質(zhì)多肽類藥物有助于提高藥物與細(xì)胞的親和性，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞對藥物的吸收。Hashizume等［22］對胰島素分子的側(cè)鏈進(jìn)行棕櫚酸修飾，得到親脂性更高的棕櫚酸?；葝u素，同位素示蹤檢測結(jié)果顯示：雙棕櫚酸衍生物的血藥濃度顯著高于未經(jīng)修飾的胰島素，單棕櫚酸衍生物則居于二者之間。此外，超氧化物歧化酶（SOD）經(jīng)棕櫚酸、月桂酸等修飾后，親脂性及穩(wěn)定性也表現(xiàn)出明顯增加，與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合也更牢［23-24］。

3.2 抵抗蛋白酶降解

體內(nèi)蛋白酶的酶促降解是導(dǎo)致蛋白質(zhì)多肽類藥物半衰期短、生物利用度低的主要原因之一。脂肪酸修飾可遮蔽蛋白質(zhì)多肽分子易受酶進(jìn)攻的區(qū)域，從而延緩或抑制蛋白水解酶的破壞作用，延長體內(nèi)作用時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)胰島素（Ins）在體外用胰蛋白酶處理4 h后降糖活性幾乎完全喪失，而硬脂酸?；葝u素（SA-Ins）、油酸酰化胰島素（OA-Ins）以及亞油酸?；葝u素（LA-Ins）在酶解8 h后仍保有一定的降糖活性，其中LA-Ins甚至在酶解10 h后仍保持約40%的降糖活性。小鼠皮下注射3 h后，LA-Ins、SA-Ins及OA-Ins均表現(xiàn)出一定的降糖作用，而Ins則已被完全清除，表明脂肪酸修飾可提高蛋白質(zhì)多肽分子的抗酶解能力、提高藥物穩(wěn)定性、延長體內(nèi)半衰期，且這種抗酶解能力隨著脂肪酸不飽和度的增加而增強(qiáng)［25］。

3.3 增強(qiáng)血漿白蛋白結(jié)合率

脂肪酸在體內(nèi)能與血漿白蛋白（human serum albumin，HSA）可逆性地結(jié)合，結(jié)合后的復(fù)合體在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中因分子過大而受到限制，因此脂肪酸修飾可延長藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間［26］。例如，胰島素只有在單體形式時(shí)才能有效穿過毛細(xì)血管壁發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)，經(jīng)脂肪酸修飾后，一方面與HSA結(jié)合增加，另一方面脂肪酸側(cè)鏈還同時(shí)促進(jìn)胰島素形成六聚體，從而延緩了胰島素從循環(huán)血液向外周靶器官的擴(kuò)散和分布，顯著延長其半衰期［27-28］。

4 蛋白質(zhì)多肽類藥物脂肪酸修飾的方法

4.1 氨基修飾

氨基?；侵舅嵝揎椀鞍踪|(zhì)多肽類藥物的常見方法。在體內(nèi)，生理性的蛋白質(zhì)多肽分子氨基端脂肪酸修飾通常是發(fā)生在N-末端Gly殘基上，多由特異性豆蔻轉(zhuǎn)移酶（N-myristoyltransferase，NMT）催化［29］。體外的氨基端脂肪酸修飾則首先需要進(jìn)行羧基活化。不同的羧基活化方法將會很大程度上影響后續(xù)氨基?；磻?yīng)的選擇性及修飾后的蛋白質(zhì)親疏水性等性質(zhì)。常用的方法有：①酰氯法，這是其中反應(yīng)活性最強(qiáng)的方法，然而，該法在水溶液（特別是堿性蛋白質(zhì)溶液）中易發(fā)生水解且選擇性差、副反應(yīng)多，因此修飾率低；②二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）法，活化羧基得到的是O-?；?，反應(yīng)迅速。但因胺類化合物會促使O-酰基脲重排生成N-?；澹苑磻?yīng)要避免使用三乙胺，盡量使用極性較小的溶劑；③活性酯（N-羥基琥珀酰亞胺酯）法，這是目前業(yè)內(nèi)較常使用的方法。在合適的pH和溫度（通常0℃左右）下，N-羥基琥珀酰亞胺酯與氨基相連形成酰氨鍵，不僅可保留蛋白質(zhì)多肽分子的生物活性，也可實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)專一性修飾［30］；④此外，還有酸酐法、活化酰胺法、疊氮化物法等方法。

4.2 羧基修飾

由于蛋白質(zhì)多肽鏈中幾種氨基活性差異很小，在進(jìn)行修飾反應(yīng)中，很難特定地修飾某一個(gè)氨基，修飾后所得的產(chǎn)物大多是混合物。因此，要獲得定點(diǎn)修飾的藥物純品，就必須要經(jīng)過復(fù)雜繁瑣的分離純化過程。受到人胰島素半合成方法的啟發(fā)，人們開始嘗試在蛋白質(zhì)多肽類藥物的修飾領(lǐng)域中改修飾氨基為修飾羧基［31］。例如，先利用羧肽酶A去掉胰島素B鏈C末端第一個(gè)氨基酸殘基，然后利用胰蛋白酶催化將連有脂肪鏈的氨基酸衍生物與之相連接，形成B鏈C端被脂肪鏈修飾的胰島素衍生物，分析顯示該修飾產(chǎn)物在體內(nèi)更加長效、穩(wěn)定，且具有潛在的口服功能。

4.3 接頭氨基酸介導(dǎo)的脂肪酸修飾

除了直接對蛋白質(zhì)多肽分子進(jìn)行脂肪酸修飾之外，還可以先制備脂肪酸修飾的氨基酸，然后通過這一接頭氨基酸與蛋白質(zhì)多肽分子進(jìn)行連接，在藥物中引入脂肪酸修飾側(cè)鏈。例如諾和諾德（Novo Nordisk）公司的利拉魯肽和德谷胰島素，均是以谷氨酸（Glu）作為接頭氨基酸，將脂肪酸連接到藥物主鏈的Lys上［32-33］。

4.4 巰基修飾與羥基修飾

此外，在體內(nèi)還存在另外2種常見的脂肪酸修飾形式。一種是Cys殘基的巰基與脂肪酸發(fā)生可逆共價(jià)結(jié)合，生成不穩(wěn)定的硫脂鍵。能夠在Cys的巰基發(fā)生修飾的脂肪酸主要有棕櫚酸、豆蔻酸、硬脂酸、花生四烯酸等，其中最常見的是棕櫚酸。另一種是Ser或Thr殘基中的羥基被脂肪酸修飾形成醚氧鍵，研究已發(fā)現(xiàn)Wnt等蛋白可在膜結(jié)合O-脂轉(zhuǎn)移酶（membrane-bound O-acyltransferases，MBOATs）作用下被棕櫚酸、棕櫚油酸及膽固醇等修飾［34-35］。目前，這2種修飾在體外藥物修飾研究方面還未見報(bào)道。

5 脂肪酸修飾藥物開發(fā)中需關(guān)注的問題

與其他修飾方法相比，脂肪酸修飾的蛋白質(zhì)藥物涉及到更多的化學(xué)過程和更為復(fù)雜的修飾產(chǎn)物高級結(jié)構(gòu)，藥物開發(fā)質(zhì)量控制需要特別考慮以下幾個(gè)方面。

5.1 修飾位點(diǎn)的選擇

如前所述，不論是何種修飾，修飾位點(diǎn)的選擇都至關(guān)重要。一般而言，修飾位點(diǎn)應(yīng)考慮設(shè)計(jì)在非活性相關(guān)位點(diǎn)區(qū)域以免影響多肽蛋白質(zhì)藥物的物理和藥理性質(zhì)。例如，研究表明：對于胰島素而言，GlyA1的修飾可能會導(dǎo)致降糖活性的部分喪失，而PheB1和LysB29的共價(jià)修飾則不僅基本上保持原有的二級、三級結(jié)構(gòu)和生物活性，還幾乎完全消除了產(chǎn)物的免疫原性和致敏性，延長了藥物的半衰期。分析還顯示PheB1和LysB29修飾后物理穩(wěn)定性均顯著增強(qiáng)，且其中PheB1修飾后的穩(wěn)定性比LysB29修飾產(chǎn)物更強(qiáng)［36］。

5.2 相關(guān)雜質(zhì)的監(jiān)測與控制

在蛋白質(zhì)多肽類藥物的脂肪酸修飾過程中，需要做好對工藝中易于引入的相關(guān)雜質(zhì)的檢測及控制工作，主要的相關(guān)雜質(zhì)包括如下方面。

①脂肪酸修飾劑及相關(guān)雜質(zhì)。脂肪酸及活化均需要通過化學(xué)合成途徑獲得，合成過程會引入工藝相關(guān)有機(jī)物雜質(zhì)，需考慮對相關(guān)工藝雜質(zhì)進(jìn)行追蹤和分析，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證和風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，確保產(chǎn)品在安全限度范圍內(nèi)。

②修飾異構(gòu)體。修飾過程中，可能由于不同修飾劑引入而產(chǎn)生多種修飾異構(gòu)體，異構(gòu)體間結(jié)構(gòu)非常相似，工藝難于去除，需建立良好的專屬性方法，對修飾雜質(zhì)譜進(jìn)行系統(tǒng)、全面的分析，并確證雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，給予風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，并結(jié)合工藝控制雜質(zhì)范圍。

③蛋白產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的監(jiān)控。對于蛋白質(zhì)多肽類藥物進(jìn)行脂肪酸修飾，需要考慮產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，針對修飾過程中可能涉及到產(chǎn)品或者中間體敏感的條件，需要特別關(guān)注與蛋白質(zhì)相關(guān)的雜質(zhì)譜變化，例如各種蛋白脫酰胺化雜質(zhì)、氧化態(tài)雜質(zhì)、旋光異構(gòu)體雜質(zhì)、降解物雜質(zhì)、聚合物雜質(zhì)、雙修飾蛋白質(zhì)、未修飾蛋白質(zhì)等，這些雜質(zhì)均應(yīng)在產(chǎn)品開發(fā)過程中予以關(guān)注，其中有些雜質(zhì)是影響產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attribute，CQA）的物質(zhì)，需要在工藝開發(fā)過程中特別重視，對每個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行溯源追蹤和風(fēng)險(xiǎn)評估，并根據(jù)分析結(jié)果予以控制。

5.3 體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)的分析

在完成對蛋白質(zhì)多肽分子的修飾之后，除了常規(guī)體外分析外，還必須重點(diǎn)對其體內(nèi)聚合情況、與HSA結(jié)合能力、消除半衰期等體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)等進(jìn)行系統(tǒng)性的分析，以明確修飾后是否可達(dá)到穩(wěn)定、緩釋的目的。

6 目前上市的脂肪酸修飾類藥物

6.1 地特胰島素

地特胰島素（detemir， Levemir，諾和平）是由諾和諾德公司研發(fā)的新型胰島素類似物，地特胰島素是將人胰島素B30位Thr去除后在B29位Lys上連接一個(gè)肉豆蔻酸側(cè)鏈而成（見圖1）［37］。皮下注射該藥后，肉豆蔻酸側(cè)鏈能有效促進(jìn)胰島素形成六聚體并與HSA發(fā)生可逆性結(jié)合，從而減緩了胰島素的體內(nèi)擴(kuò)散速度，使藥物緩慢釋放、藥效可保持24 h，達(dá)到長效降糖的作用［38］。該藥物率先于2004年在歐洲上市，2005年美國FDA也正式批準(zhǔn)其用于治療1和2型糖尿病。因安全性能良好，2011、2012年又先后被歐洲人用醫(yī)藥委員會（Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP）和美國FDA批準(zhǔn)用于2到5歲1型糖尿病患兒，此外2012年美國FDA批準(zhǔn)將地特胰島素的妊娠分類變更為B類，明確其可安全地應(yīng)用于患有糖尿病的孕婦。

圖1 胰島素和地特胰島素的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structures of insulin and detemir

6.2 利拉魯肽

利拉魯肽（liraglutide， Victoza）由諾和諾德公司研發(fā)，于2010年1月在美國上市，用于治療2型糖尿病。2014年，又被美國FDA批準(zhǔn)新增適應(yīng)證，用于治療肥胖。利拉魯肽是將人GLP-1第34位的Lys替換為Arg，同時(shí)在第26位Lys上引入一個(gè)由Glu介導(dǎo)的16碳棕櫚酸側(cè)鏈（見圖2）［39］。利拉魯肽保留了GLP-1的全部生物活性，且不良反應(yīng)顯著減少。皮下注射后，利拉魯肽可在注射部位形成膠態(tài)分子團(tuán)樣聚集體，且化學(xué)穩(wěn)定性增強(qiáng)、不易被DPP-4降解，同時(shí)還可與HSA形成可逆的復(fù)合體，這三方面因素共同作用，延緩了利拉魯肽的吸收與失活，體內(nèi)半衰期從天然GLP-1的1～2 min延長至13 h，只需每日在上臂、腹部或股部皮下注射1次，即可有效控制血糖24 h［32，40］。

圖2 利拉魯肽的結(jié)構(gòu)Figure 2 Structure of liraglutide

6.3 德谷胰島素

德谷胰島素（degludec， Tresiba）是諾和諾德公司研發(fā)的超長效基礎(chǔ)胰島素類似物。本品是將人胰島素B30位的Thr去除后，在B29位Lys上引入一個(gè)L-γ-谷氨酸連接的16碳脂肪二酸而成（見圖3）。這種結(jié)構(gòu)修飾使其在鋅離子、苯酚及間甲苯酚等的輔助下以雙六聚體形式穩(wěn)定地存在于制劑中。皮下注射本品后，隨著制劑中苯酚的迅速擴(kuò)散，雙六聚體自我聚集形成多六聚體，并在鋅離子分散過程中緩慢解離釋放出單體，吸收進(jìn)入血液循環(huán)。側(cè)鏈脂肪酸與HSA的可逆性結(jié)合進(jìn)一步減緩了藥物的吸收與擴(kuò)散速度，從而發(fā)揮長效降糖作用。德谷胰島素的藥效學(xué)曲線波動很小，可在24 h內(nèi)保持平穩(wěn)。與甘精胰島素相比，德谷胰島素在不同個(gè)體的體內(nèi)藥效學(xué)變異性更低［33，41］。德谷胰島素于2012年10月在日本上市，用于治療1、2型糖尿病，隨后于2012年11月在歐盟獲準(zhǔn)上市。其在美國的上市申請則在2013年2月被FDA拒絕，在補(bǔ)充了心血管結(jié)局試驗(yàn)中期分析數(shù)據(jù)等資料之后，2015年4月FDA接受了諾和諾德公司重新提交的上市申請。

圖3 德谷胰島素的結(jié)構(gòu)Figure 3 Structure of degludec

7 結(jié)語與展望

蛋白質(zhì)多肽類藥物與傳統(tǒng)化學(xué)藥物相比具有作用專一、高效等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也有半衰期短、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，這些問題嚴(yán)重限制了蛋白質(zhì)多肽類藥物的發(fā)展。采取化學(xué)修飾可以改變蛋白質(zhì)多肽類藥物的高級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，并保持其高度的生物活性以使其在體內(nèi)長效化。脂肪酸修飾與其他修飾劑相比，能更好地增加藥物的脂溶性，增加腸道的膜透過性，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。然而，這類制劑也有其自身的局限性，在今后的研究中還需要進(jìn)一步深入研究解決的問題主要有：一是對于藥物脂肪酸修飾位點(diǎn)的專一性研究，通過修飾條件的優(yōu)化、修飾劑的選擇、蛋白多肽中可修飾氨基酸殘基理化性質(zhì)的深入研究，使進(jìn)行修飾反應(yīng)后能夠得到單一修飾位點(diǎn)的產(chǎn)物，盡可能減少非特異性修飾位點(diǎn)產(chǎn)物；二是要開發(fā)其他蛋白多肽類藥物的脂肪酸鏈修飾產(chǎn)物，包括一些用于治療腫瘤、心血管疾病且需要長期給藥的蛋白多肽類藥物，基于已上市藥物的研究經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)其脂肪酸修飾位點(diǎn)，得到新的具有長效穩(wěn)定性的化合物；三是拓展多肽藥物化學(xué)修飾方法的新視野，將化學(xué)和生物技術(shù)的優(yōu)勢相結(jié)合，共同探索出新型的長效化技術(shù)，并力求實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

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［專家介紹］ 羅學(xué)剛 ： 副教授，碩士生導(dǎo)師。天津市“131”人才計(jì)劃第三層次人選，中國藥理學(xué)會、中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會、中國微生物學(xué)會會員。2007年6月畢業(yè)于中國藥科大學(xué)，獲微生物與生化藥學(xué)博士學(xué)位，同時(shí)進(jìn)入天津科技大學(xué)工作，現(xiàn)任天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院制藥工程教研室主任。近5年先后主持2項(xiàng)國家自然科學(xué)基金、1項(xiàng)天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目、4項(xiàng)企事業(yè)單位橫向項(xiàng)目，并作為骨干參與國家863計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金等省部級以上科研項(xiàng)目10項(xiàng)。先后發(fā)表各類科研論文60余篇，其中第一或通訊作者SCI論文19篇、EI論文13篇、中文期刊論文15篇；主編教材1部、參編英文專著1部；申請專利10項(xiàng)，其中獲授權(quán)3項(xiàng)。

Advances in Research on Modifcation of Protein and Peptide Drugs with Fatty Acids

WANG Yue1， ZHAO Wei2， XIN Zhongshuai3， ZHANG Tongcun1， LUO Xuegang1
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology Affliated to Ministry of Education & Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory，School of Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China； 2. Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co.， Ltd. Nanjing 210023， China； 3. National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

With the development of techniques in genetic engineering， protein and peptide drugs have gained increased popularity. However， their clinical application is limited by several shrotcomings such as short half-time and high immunogenicity， which leads to the recent efforts made by many researchers in various chemical modifcations of protein and peptide drugs. Compared with PEG modifcation， glycosylation and site-directed mutagenesis， modifcation with fatty acids results in good biological activity， improved stability and reduced immunogenicity of protein and peptide drugs. What's more， as important components of body fat， lipids and cell membrane phospholipids， fatty acids can increase drug lipophilicity and permeability through intestinal mucosa， and promote the association of drugs with their receptors. In this article， current advances in research on the modifcation of protein and peptide drugs with fatty acids were reviewed.

protein and peptide drug； fatty acid； modifcation

Q51； TQ464.7

A

1001-5094（2015）09-0651-08

接受日期：2015-07-08

項(xiàng)目資助：國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（2012AA022108）；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT1166）；國家自然科學(xué)基金（3130642）

*通訊作者：羅學(xué)剛，副教授；

研究方向：生物技術(shù)藥物及益生菌微生態(tài)制劑的研究與開發(fā)，腫瘤表觀遺傳與轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制；

E-mail：luoxuegang@hotmail.com