馬菲菲，郝彥強，王國強，張鑫，郅程，冀天星

上調miR-34c-5p對鼻咽癌細胞HONE-1增殖和侵襲的影響

馬菲菲1，郝彥強2，王國強3，張鑫4，郅程5，冀天星6?

目的探討上調miR-34c-5p對鼻咽癌細胞HONE-1增殖和轉移能力的影響。方法利用定量PCR分析miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1和正常鼻咽細胞株NP69中的表達情況；利用克隆形成實驗和Transwell實驗分析上調miR-34c-5p表達對miR-34c-5p mimic轉染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組增殖和侵襲能力的影響。結果miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1的表達水平低于正常鼻咽細胞株NP69；miR-34c-5p mimic轉染組鼻咽癌細胞HONE-1的克隆形成和侵襲能力明顯低于miR-34c-5p對照序列組和未處理組（均P＜0.05）。結論miR-34c-5p的下調與鼻咽癌的生物學功能增殖和侵襲能力相關，是鼻咽癌治療的潛在靶點。

鼻咽腫瘤；細胞增殖；腫瘤侵潤；體外研究；miR-34c-5p；HONE-1

鼻咽癌在我國華南地區(qū)的發(fā)病率為萬分之一～萬分之三［1］。近年來鼻咽癌患者經放化療后5年存活率有所提高，但術后復發(fā)和轉移等仍嚴重威脅著患者的生命［2］。miR-34家族成員包括miR-34a、miR-34b、miR-34c-5p、miR-34c-3p，其在多種腫瘤中呈較低表達水平，且miR-34家族成員的低表達與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關，是腫瘤治療的潛在靶標［3］。不同腫瘤中miR-34家族成員的失調的種類不同，如在鼻咽癌組織中miR-34b和miR-34c的表達水平低于正常鼻咽部組織，而miR-34a無差異性［4］。miR-34c-5p在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，但有關其具體作用及機制仍未明確。本研究旨在探討miR-34c-5p對鼻咽癌細胞株HONE-1增殖和侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料鼻咽癌細胞株HONE-1和正常鼻咽部細胞株NP69由廣東醫(yī)學院李濤老師惠贈；胎牛血清、RPMI-

1640 BPE、r-EGF的K-SFM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；miR-34c-5p mimic和miR-34c-5p對照序列購自中國銳博生物公司；脂質體2000和Trizol購自美國Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司；Real-time PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司；matrigel膠購自美國BD公司；6孔細胞培養(yǎng)板和Transwell細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組處理鼻咽癌細胞株HONE-1接種于10%胎牛血清含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，正常鼻咽部細胞株NP69接種于含有BPE、r-EGF的K-SFM培養(yǎng)液，均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至對數生長期。一部分細胞用于驗證miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1和正常鼻咽部細胞株NP6中的表達量差異；另一部分設立miR-34c-5p mimic轉染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組來確定miR-34c-5p表達對鼻咽癌細胞株HONE-1增殖、侵襲的影響。

1.2.2 定量PCR分析miR-34c-5p表達量利用Trizol法提取miR-34c-5p總RNA；利用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉為cDNA，最后利用Real-time PCR試劑盒定量分析miR-34c-5p的表達情況。以RNU6b作為內參對照，樣本靶miR-34c-5p含量以相對樣品模板量即2△Ct表示，其中△Ct=Ct靶miRCtRNU6b。引物均由上海生工生物工程公司設計，見表1。

Tab.1Primer sequences for real time PCR of miR-34c-5p and U6表1 用于定量分析miR-34c-5p和U6表達的引物序列

1.2.3 miR-34c-5p mimic和對照序列轉染以大約3×105個/孔，將HONE-1鼻咽癌細胞接種在6孔細胞培養(yǎng)平板內；細胞匯合達到70%～90%后，將細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基（1 600 μL/孔）；miR-34c-5p mimic轉染組加入400 μL miR-34c-5p mimic和脂質體2000復合物，miR-34c-5p對照序列組加入400 μL miR-34c-5p對照序列和脂質體2000復合物，輕輕混勻后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h；將轉染液移出，更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 克隆形成能力分析取miR-34c-5p mimic轉染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組對數生長期細胞，以約200個細胞/孔接種于6孔平板，置37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。倒去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，拍照并計數細胞克隆團數。各組實驗重復3次，計算各組算術平均數。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力取40 μL稀釋Matrigel加入小室中，37℃孵育2 h使Matrigel凝固；吸走小室中多余的液體，并在上室、下室分別加入100和600 μL無血清培養(yǎng)基，37℃平衡過夜；取miR-34c-5p mimic轉染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組對數生長期細胞，計數1×105個細胞，用100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL完全培養(yǎng)基；在37℃、5%CO2孵育24 h，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌1次，結晶紫染色10 min，并拍照（×200）計數。各組實驗重復3次，計算各組算術平均數。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差表示，2組間均數比較采用t檢驗。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1和NP69中的表達miR-34c-5p在HONE-1中的表達水平低于NP69（2.49±0.81 vs 164.6±1.15，t=203.631,P＜0.05）。

2.2 上調miR-34c-5p對HONE-1克隆形成能力的影響miR-34c-5p mimic轉染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組的克隆形成能力分別為56.33±6.51、92.33±6.81及94.00±12.17，差異有統(tǒng)計學意義（F=17.224,P＜0.05），其中miR-34c-5p mimic轉染組低于miR-34c-5p對照序列組和未處理組（均P＜0.05），后2組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

Fig.1The effect of up-regulating miR-34c-5p on the clone formation capacity of nasopharyngeal cancer cell line HONE-1圖1 上調miR-34c-5p對鼻咽癌細胞HONE-1克隆形成能力的影響

2.3 上調miR-34c-5p對鼻咽癌細胞HONE-1侵襲能力的影響miR-34c-5p mimic轉染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組的穿過小室的細胞數（單位：個）分別為46.67±8.39、90.00±22.91及93.33±24，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.206，P＜0.05），其中miR-34c-5p mimic轉染組低于miR-34c-5p對照序列組和未處理組（均P＜0.05），后2組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

3 討論

研究認為，鼻咽癌組織中的miR-34c-5p表達水平低于正常鼻咽部組織［4］。本研究證實，miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1中的表達水平低于正常鼻咽細胞株NP69?？寺⌒纬蓪嶒灪蚑ran?swell實驗結果顯示，miR-34c-5p mimic轉染組克隆形成和細胞侵襲能力低于miR-34c-5p對照序列組和未處理組，表明上調miR-34c-5p的表達可明顯抑制鼻咽癌細胞HONE-1的增殖和轉移侵襲能力，提示miR-34c-5p的下調參與了鼻咽癌的增殖和轉移侵襲功能特性。

同樣與正常組織比較，miR-34c-5p在其他腫瘤中也呈較低表達水平，如直腸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、喉癌等［5］。miR-34c-5p的下調與多種腫瘤的生物學功能如增殖、細胞周期進展、轉移侵襲和放化療抵抗性密切相關［6］。多種miR-34c-5p直接靶向基因如E2F3、BCL-2、c-MET、KITLG、cyclin-E等參與其抑癌作用。但在不同腫瘤中，參與miR-34c-5p抑癌的直接靶向基因有所不同［7-8］。因此，與鼻咽癌相關的miR-34c-5p直接靶向基因有待于進一步闡明。另外，與其他腫瘤不同，miR-34a在鼻咽癌中的表達未見異常，而miR-34c-5p、miR-34c-3p和miR-34b在鼻咽癌中的表達均降低［6］。這與miR-34b/c基因定位區(qū)域染色體11q23是鼻咽癌的常見缺失位點相一致，而且在此區(qū)域也發(fā)現多種與鼻咽癌相關的抑癌基因，如抑癌基因TSLC1（tumor sup?pressor in lung cancer）［9］。同時，有研究認為，啟動子區(qū)域高甲基化是TSLC1在鼻咽癌中低表達的主要原因，與其在其他腫瘤低表達的相關機制一樣，miR-34b/c在鼻咽癌中低表達與其基因啟動子區(qū)域高甲基化有關［3］。鑒于miR-34家族各成員具有不同靶基因［10-11］，因此miR-34c-5p、miR-34c-3p和 miR-34b在鼻咽癌中的抑癌作用是否具有協同性以及相關的分子機制仍值得探索。

綜上所述，miR-34c-5p下調參與了鼻咽癌的形成和進展，是鼻咽癌治療的潛在靶點，miR-34c-5p和miR-34b在鼻咽癌形成和進展中的作用和相關分子機制仍需進一步闡明。

（圖2見插頁）

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（2015-01-23收稿 2015-05-12修回）

（本文編輯 陸榮展）

The effect of up-regulating miR-34c-5p on the proliferation and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1

MA Feifei1,HAO Yanqiang2,WANG Guoqiang3,ZHANG Xin4,ZHI Cheng5,JI Tianxing6△
1-3，5-6 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China；2 Guangdong Provincial Maternity and Child Care Center；4 The First People′s Hospital of Foushan△

ObjectiveTo investigate the effect of up-regulating miR-34c-5p on cloning formation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1 in vitro.MethodsExpression levels of miR-34c-5p in nasopharyngeal cell line NP69 and nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1 were investigated by real time quantitative PCR；Cloning Forma?tion Test and Transwell Migration Assay were used to explore the effect of up-regulating miR-34c-5p on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1.ResultsThe expression of miR-34c-5p in nasopharyngeal car?cinoma cell line HONE-1 was lower than that in normal nasopharyngeal cell line NP69.Up-regulating miR-34c-5p signifi?cantly suppressed the cloning formation and migration capacity,compared to those of NP69 cell line and HONE-1 with nor?mal level of miR-34c-5p（P＜0.05）.ConclusionDown-regulating miR-34c-5p involve in proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma and may be a used as a new therapeutic target for nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal neoplasms；cell proliferation；neoplasm invasiveness；in vitro；miR-34c-5p；HONE-1

R739.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.003

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導項目（2014A010074）；廣州醫(yī)學院科研基金項目（2012A08）

1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院VIP產科（郵編510260），3胃腸外科，5病理科，6檢驗科；2廣東省婦幼保健院；4佛山市第一人民醫(yī)院

馬菲菲（1983），主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤相關分子機制和臨床分子診斷研究

△通訊作者E-mail：jitianxing7021@163.com