沈欽海，秦召敏△，劉麗，岳淑英，呂建華，魯艷芹

槲皮素對肝細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用

沈欽海1，秦召敏1△，劉麗1，岳淑英1，呂建華1，魯艷芹2

目的探討槲皮素對氧化應(yīng)激Chang liver細胞損傷的保護作用及其作用的分子機制。方法培養(yǎng)Chang liver細胞，將細胞隨機分為正常對照組、H2O2組及槲皮素低、中、高劑量組。MTT法檢測肝細胞的存活率；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。2′,7′-二氯熒光素乙二酯（DCFH-DA）細胞內(nèi)活性氧（ROS）熒光染色后，熒光顯微鏡觀察照相及流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平。試劑盒測定細胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及細胞中丙二醛（MDA）的含量。采用Western blot法檢測Nrf2蛋白的表達。結(jié)果H2O2組較正常對照組細胞存活率、SOD、GSH-Px、CAT活性降低（P＜0.05），凋亡率、平均熒光強度（MFI）及MDA升高（P＜0.05）。不同劑量槲皮素組細胞存活率及細胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT活性高于H2O2組（P＜0.05），MDA、凋亡率、MFI水平低于H2O2組（P＜0.05）。槲皮素低、中及高劑量組Nrf2蛋白均高于H2O2組（P＜0.05）。結(jié)論槲皮素對氧化應(yīng)激肝細胞損傷具有保護作用，其機制可能與激活Nrf2-ARE通路，進而增強下游抗氧化基因的表達有關(guān)。

槲皮素；氧化性應(yīng)激；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；谷胱甘肽過氧化酶；Chang liver細胞；Nrf2/ARE通路

研究認為，氧化應(yīng)激與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1］。其主要通過啟動膜脂質(zhì)過氧化、改變生物膜功能、與生物大分子共價結(jié)合及破壞酶的活性等引起不同程度的肝損傷［2］。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）及其誘導的下游靶基因是機體細胞最重要的抗氧化防御機制之一［3］。在氧化應(yīng)激過程中，Nrf2被激活誘導靶基因保護肝臟［4］。槲皮素（quercetin）是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和茶葉中［5］。研究證實，槲皮素可通過降低脂質(zhì)過氧化物水平、增加抗氧化系統(tǒng)的能力，從而對氧化損傷的肝

臟發(fā)揮保護效應(yīng)［6］；還可通過增加Nrf2的表達，提高細胞的抗氧化能力［7］。本研究利用H2O2在體外誘導Chang liver細胞建立肝損傷模型，旨在探討槲皮素對肝細胞的保護作用及其抗氧化作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料Chang liver細胞購自中南大學湘雅中心實驗室；2′,7′-二氯熒光素探針（2′,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、槲皮素、H2O2、四甲基偶氮唑藍（MTT）及二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；胰蛋白酶及胎牛血清購自美國Hyclone公司；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；Nrf2、β-actin抗體均購于美國Santa Cruze公司；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、硝酸纖維素膜購于美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組Chang liver細胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，加入1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，于37℃、5%CO2中培養(yǎng)，每2～3 d用0.25%胰酶消化傳代，直至細胞處于對數(shù)生長期。細胞隨機分為正常對照組、H2O2組、槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組及槲皮素高劑量組。正常對照組僅用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，不加任何藥物處理；H2O2組用無血清培養(yǎng)基預培養(yǎng)24 h，換液后加入含400 μmol/L H2O2的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h；槲皮素各濃度組分別用含20、40、80μmol/L槲皮素的無血清培養(yǎng)基預培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT檢測細胞活力取對數(shù)生長期Chang liver細胞，以5×104個/孔的濃度接種于96孔板，200 μL/孔，每組3個復孔，各組處理時間終止時去除培養(yǎng)基，分別加入MTT，終濃度為0.5 g/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入150 μL DMSO，搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶標儀上490 nm波長處測定各孔光密度（OD）值。求出各實驗組的細胞存活率。細胞存活率=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡峰及凋亡率細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按上述要求給予不同因素的處理后，收集各組肝細胞，離心，PBS洗滌3次，70%冰乙醇固定，制成5×106個/L細胞懸液，加樣入流式細胞儀檢測凋亡峰及凋亡率。

1.5 細胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測

1.5.1 顯微鏡觀察及檢測細胞內(nèi)ROS各組處理時間終止后，用PBS洗滌3次，用10 μmol/L DCFH-DA染液于37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5.2 流式細胞儀檢測胞內(nèi)ROS各組處理時間終止后經(jīng)PBS清洗2次，收集細胞，加入10 μmol/L DCFH-DA染液于37℃孵育30 min，用PBS洗滌3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，用流式細胞儀以激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長525 nm，檢測平均熒光強度（MFI），該值代表細胞內(nèi)活性氧水平。

1.6 細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量檢測各組處理時間終止后，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的Chang liver細胞，收集各組細胞，將細胞加100 μL細胞裂解液充分裂解后，按照試劑盒說明書檢測細胞中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量。

1.7 Western blot檢測Nrf2的表達各組處理時間終止后，收集細胞，用PBS洗滌3次，加入裂解液充分裂解，冰上裂解1 h。4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液進行蛋白質(zhì)定量，取30 μg總蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用稀釋的Nrf2一抗及標準內(nèi)參β-actin孵育，4℃過夜。洗膜后加稀釋的二抗室溫孵育2 h，滴加電化學發(fā)光（ECL）試劑，顯影、定影，結(jié)果用灰度比值表示。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SAS 6.12軟件進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測細胞存活率H2O2組較正常對照組細胞存活率降低，不同劑量槲皮素組細胞存活率較H2O2組升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1Effects of quercetin on MFI，survival rate and appotosis rate表1 槲皮素對存活率、細胞凋亡率及平均熒光強度的影響（n=3）

Tab.1Effects of quercetin on MFI，survival rate and appotosis rate表1 槲皮素對存活率、細胞凋亡率及平均熒光強度的影響（n=3）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較,b與H2O2組比較，P＜0.05；表2同

組別正常對照組H2O2組槲皮素低劑量組槲皮素中劑量組槲皮素高劑量組F存活率（%）99.06±1.57 51.46±2.82a 63.25±0.85b 87.64±2.06b 91.52±3.27b 241.18＊凋亡率（%）3.37±0.21 25.14±1.35a 13.82±1.73b 6.71±0.29b 4.26±0.95b 275.89＊MFI 20.85±0.69 63.83±1.24a 41.36±0.72b 31.67±0.48b 28.32±0.67b 127.87＊

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率H2O2組較正常對照組凋亡率增高（P＜0.05），且在正常二倍體細胞周期G0/G1峰前出現(xiàn)一個特征性的凋亡峰。不同劑量槲皮素組較H2O2組細胞凋亡率下降（P＜0.05），且凋亡峰變小，見表1、圖1。

2.3 ROS結(jié)果H2O2組較正常對照組的MFI增強，不同劑量槲皮素組MFI較H2O2組減弱（P＜0.05），見表1、圖2。

2.4 細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量H2O2組較正常對照組SOD、GSH-Px、CAT活性降低，MDA含量升高；不同劑量槲皮素組較H2O2組SOD、GSH-Px、CAT活性增加，MDA含量下降（P＜0.05），見表2。

Fig.1Results of apoptosis detected by flow cytometry in five groups of cells圖1 各組細胞流式細胞檢測凋亡圖

Fig.2ROS level in Chang liver cells observed under fluorescent microscope（×200）圖2 熒光顯微鏡觀察肝細胞中的ROS生成（×200）

Tab.2Effects of quercetin on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity表2 槲皮素對脂質(zhì)過氧化及抗氧化酶的影響（n=3,）

Tab.2Effects of quercetin on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity表2 槲皮素對脂質(zhì)過氧化及抗氧化酶的影響（n=3,）

組別正常對照組H2O2組槲皮素低劑量組槲皮素中劑量組槲皮素高劑量組F SOD（U/mL）19.14±0.93 9.18±0.74a 14.27±1.16b 16.83±0.65b 17.42±1.24b 47.75＊GSH-Px（U/mL）72.13±0.36 47.31±1.72a 56.07±1.36b 61.39±0.84b 69.82±1.92b 166.34＊＊組別正常對照組H2O2組槲皮素低劑量組槲皮素中劑量組槲皮素高劑量組F CAT（U/mg）34.92±1.64 19.53±0.75a 25.06±1.33b 28.16±1.27b 31.71±0.65b 123.29＊＊MDA（nmol/L）4.52±0.63 8.96±1.05a 6.14±0.62b 5.71±0.41b 4.83±0.68b 18.52＊

2.5 Western blot檢測Nrf2蛋白表達正常對照組、H2O2組及槲皮素低、中、高劑量組Nrf2的相對含量分別為0.24±0.02、0.35±0.01、0.46±0.04、0.58± 0.03及0.62±0.05（F=63.94，P＜0.05），其中槲皮素低、中及高劑量組均高于H2O2組（P＜0.05），見圖3。

Fig.3Expression of Nrf2 shown by Western-blot圖3 免疫印跡法檢測細胞中Nrf2蛋白的表達

3 討論

氧化應(yīng)激是指各種原因?qū)е聶C體組織或細胞內(nèi)氧自由基生成增加和（或）清除能力降低，導致ROS在體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積而造成組織、細胞損傷的一種狀態(tài)。ROS包括過氧化物、H2O2、羥自由基以及需氧反應(yīng)中產(chǎn)生的各種有害產(chǎn)物［8］。本實驗采用H2O2作用于Chang liver細胞，成功復制氧化應(yīng)激模型，結(jié)果顯示，不同劑量槲皮素組較H2O2組存活率增加，凋亡率減少，表明槲皮素能明顯提高細胞存活率，減少細胞凋亡。

ROS能夠使細胞膜上的脂類氧化，產(chǎn)生MDA，從而造成細胞損傷并引發(fā)凋亡。研究表明，槲皮素在體外可通過與金屬離子結(jié)合、清除ROS等自由基及抑制DNA損傷等發(fā)揮抗氧化作用［9］。本研究顯示，H2O2組較正常對照組MFI增強，MDA上升，不同劑量槲皮素組較H2O2組MFI減弱，MDA降低，提示槲皮素能夠降低H2O2對肝細胞造成的損傷。SOD、

GSH-Px及CAT均屬于內(nèi)源性的抗氧化酶，能夠直接清除ROS。本研究結(jié)果表明，H2O2處理可使正常肝細胞胞內(nèi)SOD、GSH-Px及CAT活性降低，而槲皮素預處理后可明顯增加H2O2處理后細胞內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活性。Nrf2屬于Cap′-n′-Collar（CNC）家族的轉(zhuǎn)錄因子［10］。通常情況下，Nrf2與其特異性受體——Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Ke?apl）偶聯(lián)結(jié)合于胞漿而使Nrf2活性處于相對抑制狀態(tài)。當氧化應(yīng)激發(fā)生時，Keapl的某些半胱氨酸殘基的疏基形成二硫鍵，從而改變了其構(gòu)象，使Nrf2與Keapl解耦聯(lián)，轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)［11］。轉(zhuǎn)入核內(nèi)的Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，調(diào)節(jié)下游包括HO-1、γ-GCS、NQ01等多種抗氧化基因的表達［12］。當細胞受到毒物或者氧化物質(zhì)作用時，Nrf2蛋白發(fā)生磷酸化解偶聯(lián)，進入細胞核內(nèi)啟動細胞內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激蛋白基因等多種細胞內(nèi)自我防御基因的表達，從而增強細胞的抗氧化應(yīng)激能力［13］。另外，各組肝細胞Nrf2蛋白的表達結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激中Nrf2蛋白的表達上調(diào)，表明氧化應(yīng)激可激活Nrf2-ARE通路，啟動內(nèi)源性保護機制，即通過調(diào)控的第Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表達而達到抗氧化應(yīng)激作用。槲皮素各組Nrf2表達高于H2O2組,表明槲皮素本身能夠增加Nrf2的表達，與文獻［7］結(jié)果一致，提示為提高細胞的抗氧化能力,在加入H2O2后可進一步增加Nrf2蛋白的表達。

綜上所述，經(jīng)槲皮素預處理可抑制細胞凋亡，提高細胞存活率，保護體外培養(yǎng)的肝細胞，這種保護作用可能與Nrf2-ARE通路的激活，進而增強體內(nèi)抗氧化性應(yīng)激系統(tǒng)、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、降低細胞凋亡有關(guān)。

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（2015-02-16收稿 2015-04-07修回）

（本文編輯 陸榮展）

Protective effects of quercetin on hepatic cell damage induced by oxidative stress

SHEN Qinhai1,QIN Zhaomin1△,LIU Li1,YUE Shuying1,LYU Jianhua1,LU Yanqin2
1 Shandong Medical College，Jinan 250002，China；2 Shandong Medicinal Biotechnology Centre△

ObjectiveTo explore the protective effects of quercetin on damage induced by oxidative stress and to clari?fy its molecular mechanism.MethodsChang liver cell cultures were randomly divided into control groups,H2O2group and 3 doses of quercetin groups.Cell survival rate was detected with MTT.Cell apoptotic rate was measured by FACS（Fluores?cence-activated cell sorting）.Intracellular reactive oxygen species（ROS）level in Chang liver cells were tested by flow cy?tometer.The DCF fluorescence intensity of DCFH-DA-stained intracellular ROS was observed by fluorescence microscope. The levels of malondialdehyde（MDA）,superoxide dismutase（SOD）,catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GSH-Px）were determined in liver cells using commercial available kits.The expression of Nrf2 were detected by Western blot.ResultsCompared with control,cell survival rate and levels of SOD,CAT and GSH-Px decreased significantly in H2O2group（P＜0.05）,while cell appotosis rate,content of MDA and mean fluorescence intensity（MFI）increased in H2O2group（P＜0.05）.In comparison with H2O2,expression of Nrf2 protein was higher in all three quercetin treatment groups（P＜0.05）.ConclusionQuercetin protected Chang liver cells from H2O2-induced oxidative stress,which may be caused by the increased ex?pressions of down stream antioxidant genes via activating the Nrf2-ARE signaling pathway.

Quercetin；oxidative stress；superoxide dismutase；catalase；glutathione peroxidase；Chang liver cell；Nrf2/ ARE pathway

R965；R657.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.004

山東省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生發(fā)展計劃項目（2011HZ099）

1山東醫(yī)學高等專科學校（郵編250002）；2山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心

沈欽海（1966），男，醫(yī)學博士，副教授,主要從事肝病的發(fā)病機制的相關(guān)研究及治療

△通訊作者E-mail:sdyzqzm@126.com