張玉琪，邢麗，汪濤

卵巢癌對順鉑類藥物耐藥性的相關分析

張玉琪，邢麗，汪濤

目的篩選影響卵巢癌順鉑耐藥性的靶點基因。方法從GEO數據庫中下載對順鉑敏感和產生抗藥性的人類卵巢癌細胞基因表達譜和甲基化譜數據（GSE15709），利用R的相關工具包篩選A2780和A2780/DDP（順鉑耐藥卵巢癌細胞系）兩類卵巢癌細胞之間的差異表達和差異甲基化的基因；使用DAVID數據庫對差異表達基因進行功能富集分析；對同時發(fā)生了差異甲基化、差異表達且甲基化水平、表達水平的變化趨勢相反的基因，進一步利用qRT-PCR技術檢測這些基因在兩種卵巢癌細胞中的表達值。結果研究發(fā)現在兩種卵巢癌細胞之間發(fā)生了416個差異表達和281個差異甲基化的基因，這些差異表達基因主要富集于細胞周期、核分裂和蛋白修飾負調控等生物過程。此外，細胞周期、DNA復制和p53等通路在這些基因中同樣富集。共發(fā)現4個發(fā)生了差異甲基化、差異表達且甲基化變化水平、表達水平變化趨勢相反的基因，qRT-PCR實驗驗證了這些基因在兩種卵巢癌細胞中的表達水平。結論利用生物信息學和分子生物學相結合的方法，可以篩選出部分影響卵巢癌對順鉑抗藥性的基因，為進一步揭示其中的分子機制提供實驗參考。

順鉑；卵巢腫瘤；計算生物學；逆轉錄聚合酶鏈反應；qRT-PCR；A2780；A2780/DDP

卵巢癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在婦科癌癥中高居第3位，死亡率居于首位［1］?；熓锹殉舶┲匾闹委熓侄危皂樸K為代表的鉑類是化療中最常使用的藥物。但其耐藥性始終是困擾臨床的一個重要問題，嚴重影響著患者的生活質量及生存率。表觀遺傳學的重要分支DNA甲基化對基因的表達調控起著非常重要的作用［2-3］。研究表明，DNA甲基化與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關［4-6］，但關于DNA甲基化和卵巢癌耐藥性的關系鮮有報道。本研究從DNA甲基化入手探究卵巢癌患者對順鉑產生耐藥性的分子機制，篩選耐藥性的分子靶標有助于進一步制定、調整卵巢癌治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌細胞A2780和A2780/DDP（順鉑耐藥卵巢癌細胞系）購自同濟醫(yī)院腫瘤中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、抗生素、Trizol均購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉錄酶、SYBR green染料購自Roche公司；順鉑（批號: 091102）購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芯片數據所用mRNA表達譜和DNA甲基化數據來自GEO數據庫中編號為GSE15709的芯片數據，由Li等［7］提供。細胞類型是A2780卵巢癌細胞，在mRNA表達譜數據中，對照組是對順鉑敏感的A2780細胞樣本，實驗組是用順鉑處理過5輪的A2780細胞樣本，各有5個生物學重復，基于GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺進行檢測；在DNA甲基化數據中，對照組為對順鉑敏感的A2780細胞樣本，有3個生物學重復，實驗組為用順鉑處理過1輪、3輪和5輪的A2780細胞樣本，各有1個，基于GPL8341平臺進行檢測。

1.2.2 芯片數據預處理對于mRNA表達譜數據，首先得到原始的CEL格式的數據，利用R統(tǒng)計軟件的affy［8］包進行背景校準和標準化，并利用芯片平臺的注釋包把探針符號轉化為基因符號；對于多個探針對應一個基因符號的情況，取探針上表達值的平均值作為該基因的表達值。DNA甲基化芯片的預處理主要包括利用背景差分去除背景噪音，利用LOESS標準化方法去除技術誤差，對于多個探針對應同一個基因的情況，取這些探針甲基化水平的平均值作為這個基因的甲基化水平。

1.2.3 差異表達和差異甲基化基因的篩選差異表達基因的篩選主要是通過芯片數據線性模型（R的limma）［9］包，對每個基因在實驗組和對照組的表達值進行t檢驗和錯誤發(fā)現率（FDR）校正。選擇FDR＜0.05并且|log2（fold change）|＞1的基因作為對順鉑有耐藥性（用順鉑處理了5輪）的卵巢癌細胞相對于對順鉑敏感的卵巢癌細胞的差異表達基因（DEG）。為了與表達譜數據相對應，本研究利用的DNA甲基化數據為用順鉑處理過5輪的卵巢癌細胞與對順鉑敏感的卵巢癌細胞進行對比；當滿足|log2（cy5/cy3）|＞1（cy5為對順鉑有耐藥性的卵巢癌細胞的甲基化水平，cy3為對順鉑敏感的卵巢癌細胞的甲基化水平）時，認為是發(fā)生了差異甲基化的基因，則記為差異甲基化基因（DEMethy）。

1.2.4 DEG的功能富集分析利用DAVID［10］（http://david. abcc.ncifcrf.gov/）在線工具，對DEG中的基因進行富集分析，選取的背景基因是人類全基因組的基因，物種是人類。最后分別以P＜0.05，并且至少富集了10個基因和P＜0.05并且至少富集了5個基因為閾值來選取富集的基因本體條目（GO terms）和KEGG通路（KEGG pathways）。

1.2.5 差異表達與差異甲基化基因的綜合分析將DEG和DEMethy中的基因進行對比，得到重合的基因。由于DNA的甲基化會抑制基因的表達，研究從重合的基因中選取甲基化和表達值的變化水平呈相反趨勢的基因。

1.2.6 細胞培養(yǎng)人卵巢癌細胞A2780和A2780/DDP接種于含10%FBS和1%雙抗（青-鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.2.7 qRT-PCR驗證為了進一步驗證基因芯片的結果，利用qRT-PCR檢測上述實驗所得DEG。Trizol法提取細胞總RNA并測定濃度，取2 μg總RNA逆轉錄為cDNA后進行qRT-PCR反應，以GAPDH作為內參，所需引物見表1。擴增條件：94℃12 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)；72℃5 min。qRT-PCR結果采用2-ΔΔCT法分析。

Tab.1Primers of G6PD，ISL1，NEFL，PSMA1 and GAPDH for qRT-PCR表1 G6PD、ISL1、NEFL、PSMA1、GAPDH的qRT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數據均以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 差異表達和差異甲基化基因以FDR＜0.05和|log2（fold change）|＞1為閾值，得到實驗組相對于對照組的DEG 416個，包括239個表達下調的基因和177個表達上調的基因。在這些DEG中，KCNJ2是差異最顯著同時變化倍數也較大的基因，TSPAN8是實驗組相對于對照組表達水平升高得最明顯的基因。本研究利用這些DEG，對樣本進行了有監(jiān)督的聚類，見圖1。實驗組和對照組都分別聚在一起，說明這些DEG在實驗組和對照組中的表達值差異是明顯的；以|log2（fold change）|＞1為閾值，得到了用順鉑處理5輪的卵巢癌細胞相對于對順鉑敏感的卵巢癌細胞的差異甲基化基因有281個，包含198個發(fā)生了低甲基化的基因和83個發(fā)生了高甲基化的基因。

2.2 DEG的功能富集分析結果通過分析發(fā)現細胞周期、蛋白質修飾過程的負調控、DNA復制和細胞增殖的調控DEG的主要富集功能。除此之外，還得到了7條在DEG中富集的KEGG通路，見表2。

2.3 DEG和差異甲基化基因的綜合分析通過對

比DEG和差異甲基化基因，得到了4個重合的基因：6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）、胰島素基因增強蛋白-1（ISL1）、神經微絲蛋白（NEFL）和蛋白酶體α型亞基（PSMA1）。并且，這4個基因的表達值變化水平和甲基化變化水平呈相反的趨勢，這也符合DNA甲基化對基因表達的影響。

2.4 qRT-PCR驗證基因芯片結果G6PD和NEFL在對順鉑敏感的卵巢癌細胞A2780中表達明顯高于卵巢癌耐藥細胞A2780/DDP，而ISL1和PSMA1在對順鉑敏感的卵巢癌細胞A2780中表達顯著低于卵巢癌耐藥細胞A2780/DDP，見表3。

Fig.1The heat map of expression levels of differential expressed genes in each sample圖1 差異表達基因在各個樣本中表達值熱圖

Tab.3Comparison of genes expressions between ovarian cancer cells that were sensitive or resistant to Cisplatin表3 qRT-PCR檢測各基因在順鉑敏感和耐藥的卵巢癌細胞中的表達情況

Tab.3Comparison of genes expressions between ovarian cancer cells that were sensitive or resistant to Cisplatin表3 qRT-PCR檢測各基因在順鉑敏感和耐藥的卵巢癌細胞中的表達情況

＊P＜0.05

細胞A2780 A2780/DDP t n33 G6PD 1.02±0.05 0.32±0.01 26.87＊ISL1 0.98±0.03 2.41±0.33 10.97＊NEFL 0.99±0.16 0.76±0.05 4.67＊PSMA1 1.04±0.18 1.68±0.11 5.86＊

3 討論

順鉑是一種廣泛應用于腫瘤化療中的藥物，以順鉑為基礎的聯合化療方案已在卵巢癌等多種疾病中表現出極為重要的抗腫瘤活性。盡管如此，受細胞獲得性及固有的耐藥性影響，患者從中獲益率還非常有限。目前，順鉑耐藥的分子機制還不明確。DNA是順鉑的主要靶點，順鉑結合會導致DNA損傷并誘發(fā)細胞凋亡。任何影響順鉑與DNA的結合以及干擾細胞凋亡的因素都可能導致耐藥性的產生。

本研究得到了實驗組相對于對照組的DEG和差異甲基化基因，這些基因主要富集于細胞周期、DNA復制和p53等信號通路，而得到的4個重合基因——G6PD、ISL1、NEFL和PSMA1，其甲基化水平的變化和表達水平的變化趨勢是相反的。進一步通過qRT-PCR實驗在RNA水平驗證這些基因在對順鉑產生了耐藥性的卵巢癌細胞中表達明顯增高。G6PD可以編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，至今已經發(fā)現了該基因兩種不同的轉錄本亞型；ISL1能夠編碼同結構域的轉錄調控因子，對胰島素基因的表達起重要的調控作用；NEFL能夠編碼神經絲蛋白，是一種有抑癌作用的異質多糖；PSMA1可以編碼泛蛋白酶體，并且由可變剪接能夠轉錄出多種轉錄本［11-12］。

NEFL神經絲輕鏈基因，隸屬于驅動蛋白超家族基因，被認為是一種抑癌基因。有研究報道NEFL基因微衛(wèi)星的雜合性缺失與多種腫瘤的發(fā)生和進展相關。G6PD是戊糖磷酸途徑所需限速酶。戊糖磷酸途徑5磷酸核糖及還原型輔酶Ⅱ都是腫瘤細胞增殖分裂的重要原料。前者是DNA、RNA合成的基礎物質，后者維持著谷胱甘肽的還原狀態(tài)。研究證實此兩者均與順鉑耐藥相關，與既往報道一致［13］。

ISL1屬于LIM同源框基因，其編碼的蛋白具有

促進細胞增殖分化、血管形成等多種生物活性。其不僅與正常的生長相關，而且是腫瘤的自分泌和旁分泌的生長因子，與腫瘤關系密切：負調控凋亡，促進細胞增殖、血管增生、細胞浸潤。PSMA1是蛋白酶體的一個亞結構，編碼高度有序，具有環(huán)形結構20 S核心α亞基［14］。蛋白酶體是真核細胞依賴泛素化對蛋白降解的重要結構。對細胞內許多功能蛋白的降解起著重要的作用，廣泛影響著多條信號通路，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。據報道，靶向藥硼替佐米就是通過抑制PSMA1而發(fā)揮抗腫瘤活性作用的［15］。但目前對PSMA1研究仍較少，特別是與順鉑耐藥性的關系少見報道。本研究篩選結果發(fā)現ISL1和PSMA1可能與卵巢癌對順鉑耐藥有關，有待于后續(xù)實驗在蛋白水平進一步驗證。

本研究通過生物信息學和分子生物學實驗相結合的手段，發(fā)現了一些可能影響卵巢癌細胞對順鉑產生耐藥性的分子靶標，有助于加深研究者關于卵巢癌對順鉑耐藥的認識，為新藥的研發(fā)提供新的思路。

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（2014-12-16收稿 2015-04-16修回）

（本文編輯 魏杰）

The analysis of cisplatin resistance in ovarian cancer treatment

ZHANG Yuqi,XING Li,WANG Tao
Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics，Tianjin 300100，China

ObjectiveTo screen the target genes that contribute to cisplatin resistance in ovarian cancer treatment. MethodsGene expression and methylation profiles of ovarian cancer cells that were sensitive or resistant to cisplatin with accession number GSE15709 were downloaded from GEO database.Differential expressed and methylated genes were identi?fied through associating packages in R.DAVID database to screen the enriched GO terms and pathways of the different ex?pressed genes between A2780 and A2780/DDP.Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）of different gene was performed against DAVID database.Genes that exhibited difference in both expression and methylation profiles between the two types of ovarian cancer cells as well as genes that present contradictory profile between expression and methylation were verified via qRT-PCR.ResultsWe found 416 different expressed genes and 281 methylated genes between the two types of ovari?an cancer cells respectively.These differential genes were rich in pathways of cell cycle,DNA replication,nucleus division，p53 signaling,and negative regulation of protein modification process etc.Four genes demonstrated contradictory profile be?tween expression and methylation in the two types of ovarian cancer cells and were verified by qRT-PCR.Conclusion Combination of bioinformatics and molecular biology is useful in the identification of target genes that contribute to resis?tance of cisplatin in ovarian cancer treatment and further reveal molecular mechanism behind it.

cisplatin；ovarian neoplasms；computational biology；reverse transcriptase polymerase chain reaction；qRTPCR；A2780；A2780/DDP

R737.31

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.006

天津市中心婦產科醫(yī)院藥劑科（郵編300100）

張玉琪（1971），女，主管藥師，本科，主要從事臨床藥學方面研究