唐玉林，米子嵐，鐘活權(quán)，江年瓊，

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳518060;2)深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060;3)深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060

來(lái)自擬南芥的一個(gè)脫水應(yīng)答基因(the Arabidopisis thaliana dehydration-responsive gene RD22，AtRD22)的cDNA中有1 179堿基對(duì)(base pair，bp)的核苷酸，編碼一個(gè)含392個(gè)氨基酸殘基的蛋白，該蛋白屬于BURP蛋白家族.BURP蛋白最初是由Hattori等定義的一類在C-端具有保守的BURP結(jié)構(gòu)域的蛋白，其命名取自于4個(gè)具有代表性成員:①油菜花粉粒胚胎發(fā)生時(shí)表達(dá)的一種蛋白(microscope-drived embryo from Brassica napus，BNM2);②蠶豆種子中豐度非貯存蛋白(abundant non-storage seed proteins from Vicia faba，USPs);③擬南芥中的一種受干旱誘導(dǎo)的蛋白(dehydration-responsive protein from Arabidopsis thaliana，RD22)［1］;④番茄果實(shí)成熟時(shí)表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶Ⅰ的β亞基(β-subunit of polygalacturonase isozyme I from Lycopersicon esculentum，PG1β)［2］.BURP 蛋白家族是植物所特有的一類蛋白，已有研究表明，它們?cè)谥参锏纳嘲l(fā)育、果實(shí)成熟以及植物抵抗生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要功能［3-6］.AtRD22蛋白是BURP蛋白家族的典型成員之一，其基本結(jié)構(gòu)如圖1.在AtRD22蛋白的BURP結(jié)構(gòu)域中存在較高比例的半胱氨酸、組氨酸和4個(gè)保守的半胱氨酸-組氨酸基序，這些氨基酸可能與二硫鍵的形成有關(guān)，也可能具有與過(guò)渡金屬離子結(jié)合的潛力，推測(cè)其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的維持和功能的發(fā)揮有重要作用，但目前尚未得到驗(yàn)證，因此，通過(guò)體外表達(dá)獲得具有活性的AtRD22蛋白對(duì)于研究該蛋白的功能具有重要意義.然而，外源蛋白在大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)中高水平表達(dá)時(shí)，新生肽鏈的聚集速率一旦超過(guò)蛋白正確折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包涵體的形成［7］.如果重組蛋白含有二硫鍵，而在E.coli體內(nèi)，由于還原性的環(huán)境不利于正確的二硫鍵的形成，導(dǎo)致重組蛋白鏈間的錯(cuò)配，也容易導(dǎo)致包涵體的形成.AtRD22蛋白的氨基酸序列中較高比例的半胱氨酸、組氨酸是與二硫鍵形成有關(guān)的氨基酸殘基，這可能是該蛋白在E.coli中表達(dá)時(shí)容易形成包涵體的原因之一，而通過(guò)蛋白可溶性分析軟件(http://biotech.ou.edu/)預(yù)測(cè)該蛋白的可溶性為 0.因此，如何在體外獲得可溶性的AtRD22蛋白是進(jìn)一步研究該蛋白結(jié)構(gòu)和功能急需解決的技術(shù)瓶頸.

圖1 AtRD22蛋白的基本結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Protein structure diagram of AtRD22

融合標(biāo)簽?zāi)軌蛟诘鞍踪|(zhì)的折疊過(guò)程中起作用，從而增加重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)［8］.pET32a載體是一種原核表達(dá)載體，利用該載體在E.coli中表達(dá)的融合蛋白含有硫氧原還蛋白A(thioredoxin A，TrxA)標(biāo)簽，有研究認(rèn)為，TrxA具有提高重組蛋白溶解性的能力［9］.pSUMO載體是由pET28a改造而來(lái)的原核表達(dá)載體，它是將一段小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)基因插入在pET28a載體的多克隆位點(diǎn)中，編碼一個(gè)約100個(gè)氨基酸殘基的小分子泛素樣修飾蛋白.利用pSUMO載體在E.coli中表達(dá)的融合蛋白含有SUMO融合標(biāo)簽，該標(biāo)簽作為重組蛋白質(zhì)表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、提高重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)等功能［10-11］.

為了獲得AtRD22蛋白以研究其結(jié)構(gòu)與功能，本研究利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法先從擬南芥總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)中克隆到了AtRD22全長(zhǎng)互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，再分別克隆到原核重組表達(dá)載體pET32a-RD22及pSUMO-RD22中，轉(zhuǎn)化E.coli進(jìn)行蛋白表達(dá).通過(guò)一系列條件的優(yōu)化，找出獲得可溶性AtRD22蛋白質(zhì)的最佳條件并鑒定了融合蛋白的表達(dá).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與載體

質(zhì)粒pET32a由本實(shí)驗(yàn)室保存;pSUMO由美國(guó)加州大學(xué)陳雪梅院士惠贈(zèng);E.coli Top10用于基因克隆;BL21(DE3)為融合蛋白表達(dá)宿主.

1.1.2 植物材料

哥倫比亞型(Columbia，Col.)擬南芥.

1.1.3 主要試劑

Trizol試劑(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、EcoRⅠ、NotⅠ、PremeSTAR、T4 DNA連接酶和DNA分子質(zhì)量標(biāo)記(Takara公司);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒(Omega公司);卡那霉素(北京鼎國(guó)公司);蛋白分子質(zhì)量標(biāo)記(Fermentas公司);His-tag小鼠單克隆抗體、兔抗小鼠二抗(Abcam公司);WTAB顯色試劑盒(上海生工).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥總RNA提取與cDNA制備

取生長(zhǎng)周期為1個(gè)月左右的擬南芥葉片2～3片(約100 mg)，采用經(jīng)典 Trizol法［12］提取 RNA，并利用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)登錄的AtRD22基因序列，由軟件Primer Premier 5.0分析并設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物(表1).

表1 實(shí)驗(yàn)引物匯總表Table1 List of primers

1.2.3 載體構(gòu)建及鑒定

1)pET32a-RD22重組載體的構(gòu)建和鑒定.以擬南芥(Col.)cDNA為模版，以 F1和R1為引物，PCR擴(kuò)增出AtRD22基因的開(kāi)放閱讀框，將PCR產(chǎn)物和pET32a空載體用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切后用T4連接酶連接，再轉(zhuǎn)化E.coli Top10，之后在含氨芐青霉素(10 mg/L)的LB平板過(guò)夜培養(yǎng)后對(duì)陽(yáng)性單克隆依次進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定，最后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證.

2)pSUMO-RD22重組載體的構(gòu)建和鑒定.以pET32a-RD22重組載體為模版，F(xiàn)2和R2為引物，擴(kuò)增AtRD22基因的開(kāi)放閱讀框，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pSUMO空載體分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，再用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli Top 10，之后在含硫酸卡那霉素(10 mg/L)的LB平板培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定，最后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證.

1.2.4 重組質(zhì)粒的原核可溶性表達(dá)條件篩選

將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒pET32a-RD22和pSUMO-RD22分別轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，在37℃ 的LB液體培養(yǎng)基中經(jīng)2次擴(kuò)大培養(yǎng)，至光密度(optical density，OD)D(600)值約為 0.8時(shí)，加入終濃度為 0.3 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dithiogalactopyranoside，IPTG)，分別在以下條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定菌液的D(600)值，并取樣檢測(cè)蛋白的表達(dá).pET32a-RD22的誘導(dǎo)條件:37 ℃ 分別誘導(dǎo) 0、0.5、1.0、1.5 和2.0 h;28 ℃ 分別誘導(dǎo) 2.0、4.0 和8.0 h;16 ℃ 分別誘導(dǎo) 6.0、8.0 和12.0 h.pSUMO-RD22的誘導(dǎo)條件:37℃分別誘導(dǎo)1.0、2.0和3.0 h;28℃分別誘導(dǎo) 2.0、4.0 和8.0 h;16 ℃ 分別誘導(dǎo)6.0、8.0和12.0 h.檢測(cè)方法:將菌液離心后，根據(jù)菌液的D(600)值加入相應(yīng)體積的平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl， pH=8.0)重懸菌體，使樣品的菌體濃度一致，各樣品留取20 μL用于總蛋白檢測(cè)，其余樣品進(jìn)行超聲破碎后離心取上清，獲得各誘導(dǎo)條件下的可溶性蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(dodecyl sulfate，sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE).

1.2.5 利用蛋白質(zhì)免疫印跡鑒定表達(dá)的融合蛋白

SDS-PAGE電泳后，采用濕法轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2.0 h后，用鼠抗6×組氨酸抗體4℃ 孵育過(guò)夜，然后用洗膜緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)為0.05%的Tween20)洗膜3次，每次5 min，加入2 000倍稀釋的兔抗鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，室溫孵育2.0 h，洗膜緩沖液洗滌3次，每次5 min，最后用W-TAB試劑盒顯色.

1.2.6 質(zhì)譜鑒定表達(dá)的目的蛋白

將誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色脫色后，挖取特異性條帶部分經(jīng)膠內(nèi)酶解［13］后，采用高分辨質(zhì)譜儀 AB SCIEX Triple TOFTM 5600檢測(cè)鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥RNA的提取及AtRD22基因的克隆

利用Trizol法提取擬南芥葉RNA后取5 μL進(jìn)行非甲醛變性核酸電泳，見(jiàn)圖2(a).RNA條帶完整，無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明該方法獲得的RNA比較完整.提取的RNA利用核酸分析儀測(cè)定得到RNA質(zhì)量濃度為 450 ng/μL，D(260)/D(280)=1.85，說(shuō)明RNA的質(zhì)量濃度可滿足反轉(zhuǎn)錄的要求.將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以cDNA為模版，F(xiàn)1和R1為引物，PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見(jiàn)一條與目的基因片段大小(1 179 bp)相符的特異性條帶，見(jiàn)圖2(b).將該P(yáng)CR片段與pET32a載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli Top10，在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜.對(duì)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定，見(jiàn)圖2(c)和圖2(d)，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確.

以pET32a-RD22為模版，F(xiàn)2和R2為引物擴(kuò)增出AtRD22基因的開(kāi)放閱讀框，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pSUMO空載體連接后轉(zhuǎn)入E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞中，在LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)后對(duì)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定，見(jiàn)圖2(e)和圖2(f)，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確.

圖2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定Fig.2 Construction and identification of recombinant expression vector

2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖3 轉(zhuǎn)化pET32a-RD22的菌中融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況Fig.3 (Color online)The expression of fusion protein using pET32-RD22

為建立適宜的AtRD22蛋白的原核表達(dá)條件，研究了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度對(duì)目標(biāo)蛋白可溶性表達(dá)的影響.結(jié)果表明誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目標(biāo)蛋白可溶性表達(dá)影響較大，見(jiàn)圖3和圖4(蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量單位:u，1 D=1 u)，而當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度分別為0.3、0.5和1.0 mmol/L時(shí)，可溶性目標(biāo)蛋白的量幾乎無(wú)變化(結(jié)果未顯示)，因此選取0.3 mmol/L作為本實(shí)驗(yàn)中的誘導(dǎo)劑濃度.轉(zhuǎn)化了pET32a-RD22和pSUMO-RD22的重組 E.coli，經(jīng)不同條件培養(yǎng)和誘導(dǎo)后，總蛋白中均分別有與各自目的蛋白分子量大小相等的特異性蛋白出現(xiàn)，且轉(zhuǎn)化了pET32a-RD22的重組菌在被誘導(dǎo)1.5～12.0 h后目的條帶清晰而粗厚，顯示其目的蛋白的表達(dá)量較高.但可溶性蛋白中的特異性蛋白的存在情況不同.在誘導(dǎo)溫度為37、28和16℃時(shí)，不同誘導(dǎo)時(shí)間后的pET32a-RD22重組菌經(jīng)超聲破碎獲得的上清液作為可溶性蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后均未見(jiàn)與目的蛋白分子量大小一致的明顯條帶.而pSUMORD22重組菌在不同的溫度和時(shí)間下誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其表達(dá)的可溶性蛋白中均有與目的蛋白分子量大小相等的特異性蛋白條帶出現(xiàn);當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃誘導(dǎo)6.0 h，或16℃誘導(dǎo)8.0 h以上時(shí)，可溶性蛋白中的特異性條帶蛋白表達(dá)量相對(duì)較高，見(jiàn)圖4(b)和圖4(c).

圖4 轉(zhuǎn)化pSUMO-RD22的菌中融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況Fig.4 (Color online)The expression of fusion protein using pSUMO-RD22

2.3 可溶性蛋白的鑒定

通過(guò)對(duì)圖4的結(jié)果分析，對(duì)轉(zhuǎn)化了 pSUMORD22重組載體的E.coli在優(yōu)化條件下，即在IPTG濃度為0.3 mmol/L時(shí)，28℃誘導(dǎo)6 h，進(jìn)行融合蛋白的表達(dá).分別取總蛋白、包涵體蛋白和可溶性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot，WB)分析，一抗為小鼠抗His抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG.結(jié)果如圖5，由圖5可見(jiàn)，在總蛋白及可溶性蛋白中均有一條約60 kD(1 D=1 u)的條帶，見(jiàn)圖5.進(jìn)一步對(duì)該特異性條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確認(rèn)該蛋白條帶為擬南芥AtRD22蛋白.證明利用pSUMO-RD22載體成功表達(dá)了可溶性的SUMO-RD22融合蛋白.

圖5 利用WB鑒定重組菌蛋白的表達(dá)Fig.5 (Color online)Identification of fusion protein using WB

3 討論

利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)異源蛋白具有簡(jiǎn)便、價(jià)廉、高效等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于科學(xué)研究中.但重組的外源蛋白在E.coli中高水平表達(dá)時(shí)經(jīng)常導(dǎo)致蛋白聚集容易形成不溶的、無(wú)活性的包涵體，而包涵體蛋白雖然較易純化，但后續(xù)的復(fù)性等工作繁瑣，且不一定能得到具有功能的蛋白，所以在體外表達(dá)可溶性的蛋白將大大簡(jiǎn)化進(jìn)一步的蛋白實(shí)驗(yàn)［7］.

目前，許多融合標(biāo)簽系統(tǒng)已作為實(shí)現(xiàn)蛋白可溶性表達(dá)和純化常用的方法，但不同的融合標(biāo)簽對(duì)于提高不同蛋白溶解性及表達(dá)量的能力不同［14］.TrxA是還原蛋白二硫鍵的催化劑，它作為融合標(biāo)簽可以提高蛋白的溶解性［15］.AtRD22蛋白中可能含有較多的二硫鍵，其在原核表達(dá)中難以進(jìn)行可溶性表達(dá)的原因之一可能是二硫鍵未能正確折疊，與TrxA融合表達(dá)后的AtRD22蛋白的大部分以包涵體形式存在，可溶性目的蛋白的量很少，這可能是由于TrxA未能促進(jìn)AtRD22蛋白的正確折疊.SUMO作為N-端融合標(biāo)簽，能夠顯著提高融合蛋白的表達(dá)量［10］.AtRD22具有親水的外表面，內(nèi)部是一個(gè)疏水核心，這種結(jié)構(gòu)可能使它對(duì)其他不溶性的蛋白以一個(gè)類似去垢劑的物質(zhì)發(fā)揮作用，能夠促進(jìn)蛋白的正確折疊［16］，提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性和可溶性［10］.本研究將pET32a-RD22轉(zhuǎn)化E.coli后表達(dá)的融合蛋白在不同的誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間下，融合蛋白的可溶性均很低，而利用pSUMO-RD22轉(zhuǎn)化E.coli表達(dá)出的融合蛋白在不同的溫度及誘導(dǎo)時(shí)間下，融合蛋白的可溶性均相對(duì)提高.由此可知，促溶標(biāo)簽對(duì)于提高AtRD22蛋白溶解性的影響較大，SUMO融合標(biāo)簽對(duì)AtRD22蛋白的促溶作用明顯優(yōu)于TrxA.利用pSUMO-RD22重組載體可在E.coli中表達(dá)出可溶性程度較高的AtRD22融合蛋白.

分析不同誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)pSUMO-RD22蛋白可溶性表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性目的蛋白的含量在1.0、2.0和3.0 h時(shí)沒(méi)有明顯改變;當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí)，可溶性目的蛋白量在誘導(dǎo)4.0和6.0 h時(shí)要明顯多于誘導(dǎo)2.0 h時(shí);當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16℃時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，可溶性目的蛋白量增加，在誘導(dǎo)的8.0和12.0 h都表現(xiàn)為有較高含量的可溶性目的蛋白.當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28和16℃時(shí)，可溶性目的蛋白量均明顯高于37℃時(shí)的獲取量.推測(cè)當(dāng)誘導(dǎo)溫度較高時(shí)，蛋白的表達(dá)速度較快，可能使得蛋白不能夠正確折疊，進(jìn)而造成蛋白的可溶性降低.這些結(jié)果說(shuō)明，低溫誘導(dǎo)有利于可溶性AtRD22蛋白的表達(dá)和積累，一定的誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)于提高可溶性蛋白的量是有效的.考慮到后續(xù)蛋白大量純化的時(shí)間和效率，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6.0 h將是誘導(dǎo)獲得該蛋白的較為合適的條件.

體外獲得具有活性的AtRD22蛋白將有利于對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而豐富對(duì)BURP蛋白家族的了解，而在E.coli中表達(dá)出可溶性的AtRD22蛋白則為這一工作奠定了基礎(chǔ).

結(jié) 語(yǔ)

本研究構(gòu)建了擬南芥AtRD22基因的原核表達(dá)載體，探索了體外表達(dá)可溶性融合蛋白的條件，結(jié)果表明，利用SUMO表達(dá)系統(tǒng)在誘導(dǎo)溫度為28℃，誘導(dǎo)6.0 h，或16℃，誘導(dǎo)8.0 h以上時(shí)，可在重組菌中表達(dá)出相對(duì)含量較多的可溶性目的蛋白.

/References:

［1］Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.The plant hormone abscisic acid mediates the drought-induced expression but not the seed-specific expression of rd22，a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsis thaliana［J］.Molecular＆ General Genetics，1993，238(1/2):17-25.

［2］Hattori J，Boutilier K A，Campagne M M L，et al.A conserved BURP domain defines a novel group of plant proteins with unusual primary structures［J］.Molecular＆General Genetics:MGG，1998，259(4):424-428.

［3］Tang Yulin，Cao Yan，Ou Zhonghua，et al.Regulatable gene expression controlled by the promoter of Sali3-2 under different abiotic stresses［J］.Journal of Shenzhen University Science and Engineering，2012，29(1):73-79.(in Chinese)唐玉林，曹 雁，歐忠華，等.非生物脅迫因子對(duì)大豆Sali3-2基因的調(diào)控作用 ［J］.深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2012，29(1):73-79.

［4］Harshavardhan V T，Son L V，Seiler C，et al.AtRD22 and AtUSPL1，members of the plant-specific BURP domain family involved in Arabidopsis thaliana drought tolerance［J］.PlOS One，2014，9(10):e110065.

［5］Tang Yulin，Cao Yan，Gao Zhan，et al.Expression of a vacuole-localized BURP-domain protein from soybean(SALI3-2)enhances tolerance to cadmium and copper stresses［J］.PlOS One，2014，9(6):e98830.

［6］Tomas Matus J，Aquea F，Espinoza C，et al.Inspection of the grapevine BURP superfamily highlights an expansion of RD22 genes with distinctive expression features in berry development and ABA-mediated stress responses ［J］.PLOS One，2014，9(10):e110372.

［7］Sorensen H P，Mortensen K K.Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli［J］.Microbial Cell Factories，2005，4(1):1-8.

［8］Young C L，Britton Z T，Robinson A S.Recombinant protein expression and purification:a comprehensive review of affinity tags and microbial applications［J］.Biotechnology Journal，2012，7(5):620-634.

［9］Dümmler A，Lawrence A M，De Marco A.Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E.coli using a modular set of vectors［J］.Microbial Cell Factories，2005，4(34):1-10.

［10］Malakhov M P，Mattern M R，Malakhova O A，et al.SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins［J］.Journal of Structural and Functional Genomics，2004，5(1/2):75-86.

［11］Zhang Licong，Li Xiaodan，Wei Dandan，et al.Expression of plectasin in Bacillus subtilis using SUMO technology by a maltose-inducible vector［J］.Journal of Industrial Microbiology＆ Biotechnology，2015，42(10):1369-1376.

［12］Logemann J，Schell J，Willmitzer L.Improved method for the isolation of RNA from plant tissues［J］.Analytical Biochemistry，1987，163(1):16-20.

［13］Hu Wei，F(xiàn)u Qiang，Zhu Pingchuan，et al.An optimized method of protein in-gel digestion for mass spectrometry identification ［J］.Journal of Southern Agriculture，2011，42(7):802-805.(in Chinese)胡 煒，付 強(qiáng)，朱平川，等.用于質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解方法的優(yōu)化 ［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42(7):802-805.

［14］Wu Shanshan，Zhu Yun，Chen Shanshan，et al.Progress in fusion tags and its applications in protein soluble expression ［J］.Chemical Industry and Engineering Progress，2014，33(4):993-998.(in Chinese)吳珊珊，朱 蕓，陳珊珊，等.融合標(biāo)簽在蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)中的應(yīng)用進(jìn)展 ［J］.化工進(jìn)展，2014，33(4):993-998.

［15］Li Juan，Liu Wen，Xiao Lei，et al.Two strategies for efficient expression of soluble recombinant human FGF-21［J］.Journal of East China Normal University Natural Science，2012(6):114-121.(in Chinese)李 娟，劉 雯，肖 磊，等.實(shí)現(xiàn)人源FGF-21高效可溶性表達(dá)的兩種策略［J］.華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2012(6):114-121.

［16］Butt T R，Edavettal S C，Hall J P，et al.SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins［J］.Protein Expression and Purification，2005，43(1):1-9.