徐立璋 余將明 李 愷 鄭學(xué)斌 鄧國英 王偉恒 黃曉東 葉曉健

鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷涂層的體外生物相容性研究

徐立璋 余將明 李 愷 鄭學(xué)斌 鄧國英 王偉恒 黃曉東 葉曉健

目的研究鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷涂層的體外生物相容性，為該涂層臨床應(yīng)用的可行性提供實驗依據(jù)。方法檢測該涂層的物理表征；檢測該涂層浸提液的離子濃度；用不同稀釋比例的浸提液培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，觀察細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞相對增殖率，并檢測細胞凋亡水平；測定溶血率。結(jié)果該涂層浸泡72 h后，浸提液中鈣、硅、鋅離子濃度均明顯升高；用不同稀釋比例的浸提液培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞都表現(xiàn)出正常的細胞形態(tài)，其中3.125%、6.25%組細胞量較多，相對增殖率高于陽性對照組，且細胞凋亡率低于陽性對照組（完全培養(yǎng)基）；隨浸提液濃度增加，可對細胞增殖產(chǎn)生輕度抑制作用，凋亡率逐漸升高；溶血試驗結(jié)果顯示，該涂層浸提液的溶血率為0.5%。結(jié)論鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷涂層沒有細胞毒性、生物相容性好，具有作為骨植入體及其他生物材料表面改性的生物學(xué)基礎(chǔ)。

鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷涂層細胞毒性凋亡生物相容性骨植入體

為提高植入體與骨組織整合的能力，應(yīng)用等離子噴涂法對鈦基表面進行改性，已成為近年來研究的熱點。羥基磷灰石（HA）與人體骨中的無機物結(jié)構(gòu)相同，具有優(yōu)良的生物活性與生物相容性[1]，已作為骨植入材料在臨床廣泛應(yīng)用[2]，但由于HA易降解及結(jié)合強度不高，常導(dǎo)致臨床長期效果欠佳[3]。

硅酸鈣生物陶瓷涂層結(jié)合強度高，且生物活性和生物相容性均優(yōu)于HA[4]，但其化學(xué)穩(wěn)定性欠佳，易降解且浸泡后結(jié)合強度明顯降低，同時導(dǎo)致pH值上升[5]，對骨細胞存在潛在的損傷，限制了其在生物學(xué)方面的應(yīng)用。為了解決硅酸鈣陶瓷材料的化學(xué)穩(wěn)定性差及機械強度低的問題，我們根據(jù)陽離子修飾鈣硅基生物陶瓷涂層的理念，將Zn離子摻雜到硅酸鈣中獲得了鋅黃長石（Ca2ZnSi2O7），并等離子噴涂于鈦合金（Ti-6Al-4V）表面，成功制備了鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷涂層。本實驗研究鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷涂層的體外生物相容性，為該涂層臨床應(yīng)用的可行性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

MC3T3-E1細胞株（中科院上海細胞生物學(xué)研究所）；α-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清（GIBCO，美國）；MTT試劑，Triton X-100，二甲基亞砜（SIGMA，美國）；FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒（BD Pharmingen，美國）。

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICPAES，瓦里安710-ES，英國）；場發(fā)射電子顯微鏡（SEM，Hitachi S-4800，日本）；X-射線衍射儀（XRD，RigakuCo，日本）；酶聯(lián)免疫測定儀（MK3，美國）；流式細胞分析儀（BECKMAN COULTER，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 涂層材料的制備

選用Ti-6Al-4V方片狀材料作為基底材料，基材根據(jù)特定參數(shù)，采用大氣等離子噴涂系統(tǒng)（APS）進行等離子噴涂，獲得10 mm×10 mm×1.5 mm、噴涂厚度為170 μm的鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷涂層材料（材料制作由中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所完成）。

1.2.2 涂層物理表征檢測

掃描電鏡觀測表面形貌，XRD分析原始粉末及涂層成份，結(jié)合強度測試檢測涂層與鈦基的結(jié)合強度。

1.2.3 材料的預(yù)處理及浸提液的制備

以丙酮、75%乙醇、去離子水各超聲清洗15 min，經(jīng)干燥箱干燥后，高溫高壓滅菌備用。用α-MEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2環(huán)境下，按材料表面積/溶液量（cm2/mL）=2.0（ISO標準：0.5~6.0 cm2/mL）的比例，對涂層進行浸提，72 h后，收集浸提液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，備細胞試驗用。使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICPAES）檢測浸提液離子濃度。以α-MEM培養(yǎng)基為稀釋液，將浸提液按照100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的比例進行逐步稀釋，作為實驗組培養(yǎng)液。

1.2.4 細胞培養(yǎng)

實驗選擇MCET3-E1細胞，以含10%FBS的 α-MEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞融合至80%~90%時消化傳代，以完全培養(yǎng)基重懸，制成1×104cells/mL的細胞懸液。以每孔200 μL種植于96孔板中，培養(yǎng)24 h及48 h后用于細胞毒性檢測；以每孔2 mL種植于6孔板中，培養(yǎng)24 h后用于細胞形態(tài)學(xué)觀察及細胞凋亡率檢測。

1.2.5 浸提液培養(yǎng)細胞

細胞培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)基，96孔板中加入100 μL浸提液作為實驗組；加入100 μL完全培養(yǎng)基作為陽性對照組（Ctr+）；在完全培養(yǎng)基中加入50 μL的0.2%Triton X-100作為陰性對照組（Ctr-）；單純100 μL培養(yǎng)基作為空白對照組組。6孔板中加入2 mL浸提液作為實驗組；加入2 mL完全培養(yǎng)基作為陽性對照組（Ctr+）；在完全培養(yǎng)基中加入1 mL的0.2%Triton X-100作為陰性對照組（Ctr-）。

1.2.6 細胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置光學(xué)顯微鏡觀察MC3T3-E1細胞在該涂層浸提液的各比例稀釋液中培養(yǎng)24 h后的黏附及伸展情況。

1.2.7 細胞毒性檢測

細胞培養(yǎng)24 h及48 h后，采用MTT法檢測吸光度值。即到各時間點后每孔加入20 μL的MTT試劑，反應(yīng)4 h后移除上清，每孔加入100 μL DMSO，反應(yīng)10 min后置入酶標儀中，在490 nm波長下檢測吸光度，每個標本重復(fù)6次。計算細胞存活率（VB）。VB=（實驗組-空白組）/（陰性組-空白組）×100%

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

每組設(shè)3個復(fù)孔，浸提液培養(yǎng)24 h，消化后收集細胞，用預(yù)冷的結(jié)合緩沖液洗滌2次，4℃下以1 000 r/min離心5 min；用結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞密度至1.0×106cells/mL，取100 μL細胞懸液置于1.5 mL EP管中，加入標記有異硫氰酸熒光素（FITC）的磷酯酰絲氨酸結(jié)合蛋白V（Annexin V）5 μL和碘化丙啶（PI）5 μL，混勻，室溫下避光孵育15 min，經(jīng)流式細胞儀分析，根據(jù)AV-FITC/PI染色情況，確定早期凋亡、晚期凋亡、壞死或正常細胞，計算細胞早、晚期凋亡率。

1.2.9 溶血試驗

按GB-T16175-2008《醫(yī)用有機硅材料生物學(xué)評價實驗方法》第13部分《溶血試驗》進行。

實驗分為3組：陰性對照組（N組）為0.9%NaCl溶液；Ca2ZnSi2O7涂層組（Z組）加入未稀釋浸提液；陽性對照組（P組）為蒸餾水。各組平行操作3個樣本。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)以SPSS 21.0進行單因素ANOVA方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Graphpad Prism 5作為制圖軟件。

2 結(jié)果

2.1 涂層的物理表征

掃描電鏡顯示，該涂層顆粒較大（約60～120 μm），表面較粗糙，凹凸不平，由融化較好、扁平的層狀顆粒堆積而成（圖1）。XRD分析顯示，原始粉末中主要成份為Ca2ZnSi2O7，含少量的Ca2SiO4與CaSiO3，該原始粉體與電弧等離子體噴涂后涂層的衍射峰位基本吻合，說明在等離子噴涂前后該材料的成份無明顯改變（圖2）。與鈦基的結(jié)合強度為（33.4±2.2）MPa。

圖1 涂層表面形貌Fig.1The surface morphology of the coating

圖2 鋅修飾硅酸鈣陶瓷原始粉體與涂層的XRD圖Fig.2XRD of Zinc-modified CaSiO3bioceramic raw powder and the coating

2.2 涂層浸提液的離子濃度

ICPAES檢測結(jié)果顯示，硅酸鈣陶瓷涂層及該涂層浸泡72 h后鈣、硅離子濃度均明顯升高，且前者明顯高于后者（P＜0.01），說明鋅離子的加入對硅酸鈣的降解具有明顯的抑制作用。而鋅離子濃度只在Ca2ZnSi2O7涂層浸泡后顯著升高（P＜0.05）（表1、圖3）。

表1 各涂層材料在α-MEM培養(yǎng)液中浸提3d后的離子濃度（Mean±SD，ppm）Table 1Ion concentration in each group after materials soaked for 3 days(Mean±SD,ppm)

圖3 各組材料浸泡3 d后Ca、Si、Zn的離子濃度Fig.3Ion concentration of Ca,Si,Zn in each group after materials soaked for 3 days

2.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置光學(xué)顯微鏡觀察顯示，MC3T3-E1細胞在該涂層各比例稀釋浸提液中均能正常貼壁生長，黏附及伸展良好，細胞呈梭形或多角形，呈伸展狀態(tài)并伸出一些細絲狀突起，其中3.125%、6.25%組細胞量較多（圖4）。

圖4 各組浸提液培養(yǎng)48 h后的細胞形態(tài)Fig.4Cell morphology after cultured in each extract group for 48 hours

2.4 細胞毒性檢測

該涂層浸提液培養(yǎng)MC3T3-E1細胞24 h、48 h，MTT試驗結(jié)果顯示，3.125%、6.25%浸提液組中細胞的相對增殖率比陽性對照組要高，隨著濃度增加，浸提液對細胞有輕度的抑制作用，但即使是100%的浸提液，其細胞存活率也大于80%。根據(jù)6級細胞毒性評定標準，其毒性為1級，沒有明顯的細胞毒性（圖5）。

圖5 MC3T3-E1細胞在各比例浸提液中培養(yǎng)24 h、48 h后的細胞活性Fig.5The activity of MC3T3-E1 cells after cultured in each proportion of extracts for 24 hours and 48 hours

2.5 細胞凋亡水平檢測

3.125 %、6.25%浸提液組培養(yǎng)的細胞凋亡率低于陽性對照組，而其他組高于陽性對照組，且實驗組隨著浸提液比例增加，早、晚期和總凋亡率逐漸升高，早期凋亡率均高于晚期凋亡率（P＜0.05）（圖6）。

圖6 浸提液培養(yǎng)24 h后的細胞凋亡率Fig.6Cell apoptosis rates after cultured in each proportion of extracts for 24 hours

2.6 溶血試驗

陰性對照組OD值應(yīng)不大于0.03，陽性對照組OD值應(yīng)在0.50～1.00范圍內(nèi)，試驗具有可信性。

在浸提液溶血試驗中，N組和P組平均OD值分別為0.005和0.748，說明結(jié)果可信。Z組平均OD值為0.004，溶血率為0.5%，無溶血反應(yīng)。

3 討論

在組織工程研究中，生物材料的理化特性直接影響細胞的反應(yīng)和最終的組織構(gòu)建[6]。而表面改性技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于提高金屬生物材料的耐磨性、耐腐蝕性和生物相容性的拓展改良方面[7-8]。

硅酸鈣具有良好的骨誘導(dǎo)能力[9]。Si離子在促進細胞增殖方面具有重要作用[10-11]。因此，硅酸鈣浸提液可以增加成骨細胞的增殖率，并可通過促進堿性磷酸酶的分泌，促進前成骨細胞的成骨分化[12]。但是，該材料生物陶瓷涂層化學(xué)穩(wěn)定性較差，降解較快，溶解率高，且與基體間的結(jié)合強度低，限制了其在醫(yī)學(xué)臨床的應(yīng)用。

鋅離子是多種酶（如堿性磷酸酶、碳酸酐酶等）的輔助因子，作為骨基質(zhì)的成份參與骨代謝。多項研究顯示，鋅能增強骨中成骨細胞的吸附和磷酸酶的活性，促進成骨表達，以及促進前成骨細胞分化、礦化[13-14]。適宜的離子濃度同樣可以促進人骨髓間充質(zhì)干細胞的黏附和增殖，增強其黏連蛋白的表達[15]；同時還能抑制體外破骨細胞的分化及活性，從而抑制骨吸收過程[16]。因此，我們選擇鋅離子作為陽離子修飾硅酸鈣陶瓷涂層的首選。

鋅修飾硅酸鈣粉體在等離子噴涂前后，其成份無明顯改變，說明此材料涂層的制備方法選擇恰當。該涂層表面粗糙、多孔的結(jié)構(gòu)，有助于骨組織在其表面的生長，改善植入體與骨組織之間的結(jié)合[17]。涂層表面宏觀的凹凸樣紋同樣影響到涂層的受力狀態(tài)，表面粗糙度有利于將宏觀的剪切應(yīng)力部分轉(zhuǎn)化成局部的正壓應(yīng)力，有利于涂層在應(yīng)力下的穩(wěn)定。該涂層浸提液鈣、硅離子濃度明顯低于硅酸鈣涂層，說明其具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性。我們由此推斷，鋅對于鈣硅基陶瓷材料的溶解性具有較大的阻礙作用，且該涂層具有一定的抗菌性能[18]。

本實驗中，MC3T3-E1細胞在各浸提液稀釋液中均貼壁生長良好，MTT試驗表明，3.125%和6.25%組的細胞相對增殖率較高，但隨浸提液比例升高，對細胞生長有輕度的抑制作用。有研究顯示，鋅離子濃度約在（1×10-6）～（1×10-4）mol/L時，能促進MC3T3-E1細胞增殖分化[19]。該涂層釋放鋅離子的濃度約為（1.39±0.12）×10-4mol/L，與此范圍接近，且該涂層還可以緩釋人體骨代謝必須的鈣離子、硅離子。因此，該涂層析出的低濃度離子具有促進前成骨細胞黏附和增殖的作用。低濃度鋅離子還具有抑制細胞凋亡的作用[20]，流式細胞檢測結(jié)果顯示，3.125%和6.25%組的細胞凋亡率均低于陽性對照組，和MTT試驗結(jié)果一致，說明合適的浸提液比例擁有優(yōu)秀的抗凋亡能力。該涂層溶血率為0.5%，無溶血反應(yīng)，顯示了本涂層材料具有良好的血液相容性。因此，該涂層基本沒有細胞毒性，是安全可靠的。

本實驗結(jié)果表明，該涂層具有化學(xué)穩(wěn)定性好，與鈦基結(jié)合強度高，毒性低，促細胞黏附生長，抗凋亡等優(yōu)點，且抗彎強度和斷裂韌度強[21]，具有作為骨植入體及其他生物材料表面改性的生物學(xué)基礎(chǔ)，擁有良好的臨床應(yīng)用前景。

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The Biocompatibility of Zinc-modified CaSiO3Bioceramic Coating in vitro

XU Lizhang1,YU Jiangming1,LI Kai2, ZHENG Xuebin2,DENG Guoying1,WANG Weiheng1,HUANG Xiaodong1,YE Xiaojian1.

1 Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,China;

2 Shanghai Institute of Ceramics,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200050,China.Corresponding author:YE Xiaojian(E-mail:xjye2012@126.com).

ObjectiveTo study the biocompatibility of zinc-modified CaSiO3bioceramic coating in vitro,and to provide experimental basis of its clinical application.MethodsThe physical characteristic of the coating and the concentration of differentions extracted from the coating were detected.Then the extract was used in MC3T3-E1 cells culture with different concentrations for cellular morphological observation,including the relative growth rate measured by MTT and the apoptosis rates detected by flow cytometry.Hemolysis ratio of the coating was also detected.ResultsCalcium,Silicon,Zinc ion concentrations of the coating's extract were significantly increased after immersion for 72 hours.All cells cultured with different proportions of diluent showed normal cellular morphology.Cells cultured in group 3.125%and 6.25%had larger quantity,higher relative increment rate and lower apoptosis rate,compared to positive control group(complete medium). Alone with the increasing concentrations,mild inhibition to the cells and increasing apoptosis rate were observed.The hemolysis rate of the coating's extract detected by hemolysis test was 0.5%.ConclusionThe Zinc-modified CaSiO3bioceramic coating with non-cytotoxicity and good biocompatibility has the biological basis of surface modification for bone implants and other biological material.

Zinc-modified CaSiO3bioceramic coating;Cytotoxicity;Apoptosis;Biocompatibility;Bone implants

Q813.1+2

A

1673－0364（2015）04－0229－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.003

2015年3月23日；

2015年5月12日）

國家自然科學(xué)基金項目（81472071）；863計劃（2013AA032203）。

200003上海市第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科（徐立璋，余將明，鄧國英，王偉恒，黃曉東，葉曉?。?；200050上海市中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所（李愷，鄭學(xué)斌）。

葉曉健（E-mail：xjye2012@126.com）。