項(xiàng)露頡，孫麗敏，趙 佳，白 曼，阮紅玲，姜懷志（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

遺傳育種

不同雜交組合肉羊肌肉組織中MyoD基因mRNA表達(dá)的研究

項(xiàng)露頡，孫麗敏，趙 佳，白 曼，阮紅玲，姜懷志
（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

生肌決定因子（MyoD）是脊椎動(dòng)物胚胎期肌肉發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控基因之一。為了研究MyoD基因mRNA在不同雜交品種肉羊之間的表達(dá)差異，試驗(yàn)選取杜泊羊與東北細(xì)毛羊雜交（杜東組），小尾寒羊與東北細(xì)毛羊雜交（小東組）的兩組雜交品種羊各3只，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)MyoD基因的表達(dá)量。結(jié)果表明：MyoD在各組羊胸肌、后腿肌、背最長(zhǎng)肌中均有表達(dá)，且在不同雜交組合的同一肌肉組織中表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）；MyoD基因在杜東組中胸肌的相對(duì)表達(dá)量為小東組的1.96倍，杜東組中的后腿肌相對(duì)表達(dá)量為小東組的6.30倍，杜東組中背最長(zhǎng)肌的相對(duì)表達(dá)量為小東組的1.48倍。

肉羊；MyoD；基因表達(dá)

隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改善，羊肉以其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味倍受人們的青睞，進(jìn)而促進(jìn)了肉羊產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展。國(guó)外肉羊業(yè)發(fā)展的經(jīng)驗(yàn)表明，利用品種間的雜種優(yōu)勢(shì)，采用經(jīng)濟(jì)雜交方式是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羊肉最為有效的方法之一。肉羊的主要經(jīng)濟(jì)性狀是產(chǎn)肉性狀和肉質(zhì)性狀，而這二者是與其肌纖維數(shù)量和生長(zhǎng)密切相關(guān)的［1］，MoyD（myogenicdiffercntiation 1）基因是正向調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的生肌調(diào)節(jié)因子家族（MRFS）成員之一，與成肌細(xì)胞增殖和肌肉增生有關(guān)，能促使多種肌細(xì)胞的增殖，并調(diào)節(jié)單核的成肌細(xì)胞分化為多核的肌纖維［2］。國(guó)內(nèi)在豬［3-4］、肉牛［5］、山羊［6］等動(dòng)物的相關(guān)研究表明，MoyD基因與動(dòng)物的產(chǎn)肉性狀和肉質(zhì)性狀具有極其密切的相關(guān)性，可以作為動(dòng)物產(chǎn)肉性狀及肉質(zhì)性狀的遺傳標(biāo)記。

自上個(gè)世紀(jì)90年代末期以來(lái)，我國(guó)肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但由于缺乏專門化的肉用綿羊品種，各地紛紛利用引進(jìn)的國(guó)外優(yōu)質(zhì)肉羊品種與本地綿羊品種進(jìn)行二元或三元雜交來(lái)發(fā)展當(dāng)?shù)氐娜庋虍a(chǎn)業(yè)，建立了多種不同的雜交組合模式。吉林省西部農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)近20年來(lái)，先后引進(jìn)多個(gè)國(guó)外肉用綿羊良種，但由于種羊群體規(guī)模較小，廣大農(nóng)戶仍以小尾寒羊與當(dāng)?shù)丶?xì)毛羊的雜種作為發(fā)展肉羊的主要模式。因此，為了比較不同父本品種與當(dāng)?shù)匮虻碾s交效果，本研究開展了對(duì)不同父本來(lái)源的雜交組合羊主要產(chǎn)肉部位肌肉中MoyD基因表達(dá)水平的檢測(cè)，為篩選和優(yōu)化肉羊雜交組合提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年春季于吉林省乾安志華種羊繁育公司的商品肉羊群中，分別在杜泊羊（）×東北細(xì)毛羊（♀）（簡(jiǎn)稱杜東組）、小尾寒羊（）×東北細(xì)毛羊（♀）（簡(jiǎn)稱小東組）2個(gè)雜交組合中選取出生日期相近，并在相同飼養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的10月齡育肥羊，屠宰后采集背最長(zhǎng)肌、胸肌、腹肌3個(gè)部位的樣品，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、純化試劑盒、6×DNA loading buffer、DL 2000dNA Marker、PCR Master Mix、瓊脂糖、RNAiso Plus、SYBRgreen Realtime PCR Master Mix等均為Takara公司產(chǎn)品。9700PCR儀和Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；Tanon2000凝膠成像系統(tǒng)；紫外分光光度計(jì)（GeneQuantⅡ，Pharmacia Biotech）。

1.3 熒光定量PCR

1.3.1 總RNA提取和cDNA的合成 肌肉總RNA的提取按Trizol法進(jìn)行，RNA樣品經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，用核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)提取的總RNA濃度。cDNA第1鏈合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系：模版cDNA 2μL，F(xiàn)orward Primer 2μL，Reverse Primer 2μL，2×Taq MasterMix25μL，RNase Freeh2O 19μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，26個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min。-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上公布的綿羊MyoD mRNA和β-actin mRNA序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)MyoD mRNA和β-actin mRNA的引物，由大連寶生物工程公司合成，熒光定量目的基因的引物信息見表1。

1.3.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR采用SYBR熒光染料法，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量，根據(jù)SYBRgreen Realtime PCR Master Mix建立PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)總體系為20μL：其中10μL SYBRgreen Realtime PCR Master Mix，0.8μL PCR Forward Primer（10μM），0.8μL PCR Reverse Primer（10μM），2μL cDNA模板，6.4μLddH2O。95℃預(yù)變性1min。PCR循環(huán)參數(shù)：變性95℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，45s，循環(huán)40次，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品（各重復(fù)3次）。

表1 熒光定量的目的基因的引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

參照Winer等方法，利用2-ΔΔCt法測(cè)定MyoD基因的相對(duì)表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參基因校準(zhǔn)；對(duì)獲得的數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

由表2可見，MyoD基因mRNA在2種不同雜交組合肉羊的胸肌、腿肌和背最長(zhǎng)肌中均有表達(dá)，說(shuō)明該基因不僅是調(diào)控純種地方綿羊肌肉肉質(zhì)的候選基因，也是調(diào)控雜交肉羊肌肉肉質(zhì)的候選基因。MyoD基因mRNA在杜東組試驗(yàn)羊胸肌、腿肌、背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平均顯著高于小東組試驗(yàn)羊同一部位的表達(dá)水平（P＜0.05），且分別為小東組試驗(yàn)羊相應(yīng)部位肌肉中表達(dá)量的1.96倍、6.30倍和1.48倍。MyoD基因mRNA在杜東組試驗(yàn)羊肌肉組織中的表達(dá)量為后腿?。颈匙铋L(zhǎng)?。拘丶?，而其在小東組試驗(yàn)羊肌肉組織中的表達(dá)量為背最長(zhǎng)肌＞胸?。竞笸燃。f(shuō)明雜交肉羊的主要產(chǎn)肉部位發(fā)育受其父本的影響較大。

表2 2種雜交組合肉羊不同部位肌肉中MyoD基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

動(dòng)物的產(chǎn)肉潛力及肌肉品種與肌纖維數(shù)量和生長(zhǎng)密切相關(guān)，所有脊椎動(dòng)物在出生后，其肌肉中的肌纖維數(shù)量是恒定的，即其肌纖維數(shù)量是胎兒期形成的，動(dòng)物生后的肌肉生長(zhǎng)主要依賴于肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化而導(dǎo)致肌纖維長(zhǎng)度和周徑增加，而不是依賴于肌細(xì)胞數(shù)量的增殖［6］。MyoD基因是調(diào)控肌肉生成的重要基因，其表達(dá)對(duì)維持肌細(xì)胞分化有重要作用，胚胎期MyoD基因缺失可導(dǎo)致成肌細(xì)胞的增殖和分化無(wú)法進(jìn)行［7］。而MyoD基因在動(dòng)物出生后的主要作用則起到促進(jìn)多種類型細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成肌細(xì)胞，能促使成肌細(xì)胞融合成肌管，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育［8］。

Brune等［9］研究發(fā)現(xiàn)，MyoD基因在不同類型的肌肉組織中有不同的表達(dá)模式，并認(rèn)為這種差異來(lái)自于肌肉組織的起源不同。胸肌和腿肌在起源和形成過程中存在一定的差異，胸肌主要是由軸下生肌節(jié)的成肌細(xì)胞融合而成，腿肌則是由軸下生肌節(jié)的成肌細(xì)胞遷移到肢芽處分化而成的。陶志云等［10］對(duì)高郵鴨和金定鴨胚胎期的骨骼肌發(fā)育作用的研究中發(fā)現(xiàn)，MyoD基因在不同肌肉中具有不同的表達(dá)模式。而本試驗(yàn)也表明，杜東組和小東組肉羊3個(gè)不同部位的肌肉中存在MyoD基因mRNA的表達(dá)差異。

中國(guó)是全世界最大的綿羊飼養(yǎng)國(guó)和羊肉第一生產(chǎn)大國(guó)。雖然中國(guó)有140個(gè)綿山羊品種，但固有的綿山羊地方品種中沒有專門化的肉用綿羊品種，所生產(chǎn)的羊肉平均胴體重僅為15kg左右。因此，全國(guó)各地在發(fā)展肉羊生產(chǎn)時(shí)，已經(jīng)開始關(guān)注產(chǎn)肉性狀和肉質(zhì)性狀的選育與提高。馬海玉等對(duì)阿勒泰羊MyoD基因的遺傳多態(tài)性及其與產(chǎn)肉性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析，證實(shí)MyoD基因可以作為阿勒泰肉羊產(chǎn)肉性能的候選基因［11］。由于目前國(guó)內(nèi)在肉羊生產(chǎn)中普遍采用國(guó)外引進(jìn)優(yōu)質(zhì)良種與地方品種的經(jīng)濟(jì)雜交模式，但在雜交組合篩選中很少關(guān)注不同雜交組合不同部位肌肉的發(fā)育狀況，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，杜東組羊主要產(chǎn)肉部位MyoD基因表達(dá)水平顯著高于小東組羊，正好證實(shí)了國(guó)外引進(jìn)的專門化肉用綿羊品種改良本地羊后，可以促使雜種機(jī)體的主要產(chǎn)肉部位肌肉優(yōu)先發(fā)育的現(xiàn)象，為國(guó)內(nèi)進(jìn)一步開展肉羊雜交改良父本品種的選擇提供了理論依據(jù)。

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Expression of MyoD Gene mRNA in the Muscle Tissues of Different Hybrid Mutton Sheep

XiangLujie，Sun Limin，JiangHuaizhi，et al
（College ofAnimal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Myogenic determination gene（MyoD）is one of the dominant genes in muscle development in vertebrate embryonic.In order to study the expression of MyoD mRNA in the muscle tissues of different breeds of sheep，the bybrids of Dorper sheep and Small Tail Han Sheep with Northest Fine Wool sheep were used todetect the expression ofMyoD byfluorescence quantitative PCR reaction.The results showed that MyoD gene expression in the pectoral muscle，leg muscle and longissimus muscle in different groups had significant difference(P＜0.05)；the relative expression in pectoral muscle of MyoD in DD（hybrid of Dorper sheep with Northest Fine Wool sheep）group was 1.96 times as much as the relative expression ofMyoD in XD（hybrid of Small Tail Han sheep with Northest Fine Wool sheep），the relative expression in leg muscle of MyoD in DD group was 6.30 times as much as that in XD，the relative expression in longissimus muscle ofMyoD in DDgroup was 1.48 times as much as that in XD.

mutton sheep；MyoD；gene expression

S826.2

A

2095-3887（2015）05-0001-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.05.001

2015-05-20

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20110237）、（20120802）

項(xiàng)露頡（1992-），女，碩士研究生。

姜懷志（1968-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事綿山羊遺傳育種方面的研究工作。