李運(yùn)書，孟祥碩，崔 策，嚴(yán)美悅，王春艷?

（1.承德醫(yī)學(xué)院2012級麻醉本科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院2011級麻醉本科；3.承德醫(yī)學(xué)院2012級中西醫(yī)臨床本科；4.指導(dǎo)教師）

葉酸對胚胎大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

李運(yùn)書1，孟祥碩2，崔 策1，嚴(yán)美悅3，王春艷4?

（1.承德醫(yī)學(xué)院2012級麻醉本科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院2011級麻醉本科；3.承德醫(yī)學(xué)院2012級中西醫(yī)臨床本科；4.指導(dǎo)教師）

葉酸；胚胎；大鼠；心肌；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2

先天性心臟病發(fā)病率約為4.05%-12.30%，是我國城市0-5歲嬰幼兒死亡的首要原因［1］。葉酸應(yīng)用于預(yù)防心臟畸形始于20世紀(jì)90年代，但其作用機(jī)制尚未明確［2］。細(xì)胞凋亡是與增殖相反的細(xì)胞活動，胚胎細(xì)胞適度和適量的凋亡是器官外形正常建立的基礎(chǔ)。本研究給予孕鼠葉酸干預(yù)，觀察對胎鼠心肌細(xì)胞凋亡率、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，探討葉酸對胎鼠心臟發(fā)生、發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡的作用，為葉酸預(yù)防先天性心臟畸形的機(jī)制及安全劑量研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組、給藥 10周齡健康清潔級SD大鼠，體重210-250g（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供）。動物室室溫為22±2℃，濕度45±5%，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝水。大鼠隨機(jī)分為小、中、大劑量葉酸組和對照組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后， 按雌雄2：1比例合籠，次晨查陰栓，陽性者即確定受孕。從受孕日起，大、中、小劑量葉酸組分別灌胃給予葉酸（上海生物化學(xué)制品廠）2mg/kg/d、1mg/kg/d、0.5mg/kg/d。對照組灌服等量生理鹽水。

1.2 取材及制片 各組孕鼠均于ED13.5處死，每只孕鼠隨機(jī)取2只胎鼠的心臟，常規(guī)固定包埋，連續(xù)切片。每隔10張取7張（1套），每1心臟取10套，裱貼于APES載物片上，待染。

1.3 染色 免疫組化染色采用SP法，經(jīng)過抗原修復(fù)、滴加一抗、二抗、三抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。Mivnt顯微圖像分析系統(tǒng)對切片陽性物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

1.4 TUNEL末端標(biāo)記法 切片常規(guī)脫蠟至水、消除內(nèi)源性過氧化物酶、加入新鮮配制的TUNEL反應(yīng)液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。TUNEL凋亡檢測試劑盒、Bax、Bcl-2一抗、免疫組化試劑盒均購自中杉金橋生物公司。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計處理，葉酸干預(yù)影響采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎鼠心肌細(xì)胞凋亡率 各組胎鼠均可見凋亡陽性心肌細(xì)胞，其細(xì)胞核呈棕褐色。葉酸干預(yù)組細(xì)胞調(diào)亡率較對照組明顯降低（P＜0.01）。不同劑量葉酸組間比較，大、中劑量組較小劑量組顯著降低（P＜0.05）；大劑量組與中劑量組比較無明顯差異（P＞0.05）（見附表）。結(jié)果提示，葉酸具有抑制胚胎心肌細(xì)胞凋亡的作用，且葉酸抗凋亡作用與劑量有關(guān)。

2.2 胎鼠心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2的表達(dá) Bax和Bcl-2在各組胎鼠心肌細(xì)胞均有表達(dá)，陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，多位于細(xì)胞漿內(nèi)，少數(shù)胞漿和胞核同時表達(dá)。葉酸干預(yù)組Bax表達(dá)明顯低于對照組（P＜0.01）， Bcl-2表達(dá)顯著高于對照組（P

＜0.05），提示葉酸能抑制Bax表達(dá)，提高Bcl-2的表達(dá)。不同劑量組間比較，大、中劑量組Bax和Bcl-2表達(dá)與小劑量組比較差異顯著（P＜0.05）；大劑量組與中劑量組比較無明顯差異（P＞0.05）（見附表）。不同劑量組表達(dá)量的不同，提示劑量大小與葉酸調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2表達(dá)的作用程度有關(guān)。

附表 各組胎鼠心肌細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2表達(dá)（±s，n=10）

附表 各組胎鼠心肌細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2表達(dá)（±s，n=10）

與對照組比較：aP＜0.01，bP＜0.05；與小劑量組比較：cP＜0.05；與中劑量組比較：dP＞0.05

組別 凋亡率（%） Bax Bcl-2對照組 24.8±6.47 0.24±0.036 0.19±0.061小劑量組 16.19±3.03a0.18±0.045a0.26±0.044b中劑量組 11.13±3.83ac0.13±0.032ac0.37±0.035bc大劑量組 10.28±3.66acd0.11±0.027acd0.39±0.037bcd

3 討論

細(xì)胞凋亡是解決胚胎器官發(fā)生、外形雕刻的重要細(xì)胞生物學(xué)事件。與增殖一樣，胚胎細(xì)胞凋亡的發(fā)生時間、強(qiáng)弱在各種凋亡相關(guān)基因（如Bax、Bcl-2、P16等）的嚴(yán)格調(diào)控下進(jìn)行［3］。目前認(rèn)為，原癌基因Bcl-2是主要的抗凋亡基因，可以抑制多種轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的凋亡。Bax與Bcl-2功能完全相反，且是Bcl-2的拮抗基因， 通過編碼相應(yīng)功能蛋白起作用［4］。Bax與Bcl-2既能各自形成同源二聚體，又能互相作用形成異源二聚體，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

本研究通過灌胃給予受孕大鼠不同劑量葉酸，發(fā)現(xiàn)葉酸明顯降低了胎鼠心肌細(xì)胞Bax的表達(dá)、提高了Bcl-2的表達(dá)。結(jié)合TUNEL標(biāo)記結(jié)果，葉酸干預(yù)組胎鼠心臟凋亡細(xì)胞率降低，共同提示葉酸可能通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2兩種凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而降低胎鼠心肌細(xì)胞的凋亡。Bax、Bcl-2之間表達(dá)平衡的改變，可能是葉酸拮抗心肌細(xì)胞凋亡作用的分子機(jī)制之一。本研究結(jié)果與Wu等［5］一致，他們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸能顯著減少STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。關(guān)濤等［6］學(xué)者在研究畸形發(fā)生機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PMX誘導(dǎo)實驗動物發(fā)生NTD，其機(jī)制可能與PMX阻斷了葉酸的代謝通路、導(dǎo)致神經(jīng)上皮細(xì)胞過度凋亡有關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著葉酸濃度的增加，胎鼠心肌細(xì)胞凋亡率按對照組、小、中、大劑量葉酸干預(yù)組順序呈逐漸下降趨勢，提示劑量大小與葉酸調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的作用程度有關(guān)。

總之，葉酸可降低胎鼠心肌細(xì)胞促凋亡因子Bax的表達(dá)、提高抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，并降低胎鼠心肌細(xì)胞的凋亡率。一定劑量范圍內(nèi)，葉酸下調(diào)Bax、上調(diào)Bcl-2表達(dá)及降低凋亡率的作用與劑量有關(guān)。葉酸預(yù)防畸形的作用機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)凋亡基因的表達(dá)有關(guān)。

［1］吳明昌.先天性心臟病在圍生期的評估［J］.中國醫(yī)刊，2002，37（1）：4-6.

［2］楊江帆，楊戎威，李瑋，等.葉酸預(yù)防先天性心臟病的作用［J］.中國新生兒科雜志，2007，2（3）：129-132

［3］于素香，孫玉國，王春艷.葉酸對妊娠大鼠胎盤細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，29（2）：128-130.

［4］Pickell L， Brown K， Li D， et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice［J］. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol， 2011，91（1）：8-19.

［5］Wu TG，Li WH，Lin ZQ，et a1.Effects of folic acid on cardiacmyocyte apoptos is in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus［J］.Cardiovasc Drug Ther.2008，22（4）：299-304.

［6］關(guān)濤，王秀偉，官臻，等.PMX誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形及其對神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2011，27（4）：447-452.

（學(xué)生園地欄目編輯：張 ?。?/p>

R944.9

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1004-6879（2015）03-0259-03

2015-04-02）