婁劍鋒，雷世勇，竺俊全＊，吳雄飛

（1.寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波315211；2.寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江 寧波315012）

大黃魚(yú)（Pseudosciaenacrocea）隸屬鱸形目石首魚(yú)科黃魚(yú)屬，為我國(guó)重要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一。以往因過(guò)度捕撈及近海環(huán)境污染等原因，自然資源嚴(yán)重衰退。為有效保護(hù)大黃魚(yú)資源及發(fā)展其增養(yǎng)殖業(yè)，1985年福建省率先開(kāi)展了官井洋大黃魚(yú)人工繁育技術(shù)攻關(guān)，于1986年獲得成功后在全國(guó)推廣養(yǎng)殖。而浙江岱衢洋大黃魚(yú)的養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)相對(duì)滯后。由于岱衢洋大黃魚(yú)比官井洋大黃魚(yú)更適宜于浙江海區(qū)（特別是舟山、寧波）的養(yǎng)殖條件，而且岱衢洋大黃魚(yú)因體型、體色及肉質(zhì)與品味俱佳而歷來(lái)受消費(fèi)者青睞，養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)及市場(chǎng)潛力極大。浙江省高度重視岱衢洋大黃魚(yú)的開(kāi)發(fā)，2008年寧波市岱衢洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)課題組在岱衢洋海域采捕野生大黃魚(yú)，經(jīng)?；?、馴養(yǎng)達(dá)性成熟8尾，以之為親本繁育與育種。由于種源材料與以往不同，其遺傳多樣性需要重新認(rèn)識(shí)。

目前對(duì)大黃魚(yú)的遺傳多樣性研究已有較多報(bào)道［1－3］。國(guó)內(nèi)學(xué)者也通過(guò)形態(tài)學(xué)［4］、RAPD［5］、微衛(wèi)星［6－7］、ISSR［8］及線粒體基因［9］等方法探討了岱衢族和閩東族大黃魚(yú)群體間的遺傳差異，但利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（AFLP）對(duì)其之間的比較研究?jī)H見(jiàn)Hung等［10］報(bào)道的閩東族和岱衢族養(yǎng)殖大黃魚(yú)及其雜交子代遺傳差異分析。AFLP分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了RFLP的準(zhǔn)確性和PCR的高效性，具有信息量大、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，這體現(xiàn)在對(duì)福建官井洋大黃魚(yú)（閩東族）指紋多態(tài)性的研究［11］、對(duì)人工雌核發(fā)育大黃魚(yú)（閩東族）的鑒定及遺傳規(guī)律分析［12］、對(duì)福建閩東地區(qū)野生和養(yǎng)殖大黃魚(yú)（閩東族）的種質(zhì)資源調(diào)查［13］，對(duì)采捕野生岱衢族大黃魚(yú)的種質(zhì)分析等［14］。我們運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)岱衢洋大黃魚(yú)（岱衢族）人工繁育二代（F2）養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，并比較其與官井洋大黃魚(yú)（閩東族）人工繁育多代養(yǎng)殖群體間的遺傳差異，以期為岱衢洋大黃魚(yú)的育種提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)于2012－04取自寧波象山港海區(qū)的大黃魚(yú)養(yǎng)殖網(wǎng)箱，岱衢洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體20尾（以2008年寧波市岱衢洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)課題組在岱衢洋海域采捕的野生大黃魚(yú)為親本，于2011－03人工繁育的第二代），個(gè)體重80～130g；官井洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體20尾（以1985－1986年官井洋野捕大黃魚(yú)為親本多代人工繁育的后代，即2011世代），個(gè)體重50～80g。取每尾魚(yú)的少量肌肉組織，分別置于滅菌過(guò)的1.5mL凍存管中，放入液氮罐中帶回寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，于超低溫冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取

DNA提取參照《分子克隆手冊(cè)實(shí)驗(yàn)指南》［15］。取大黃魚(yú)肌肉組織約100mg，剪碎后加600μL STE裂解液、1μL RNase、5μL蛋白酶K（20mg／mL），56℃水浴1～2h至澄清，然后用改良的酚－氯仿法抽提基因組DNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。選取抽提質(zhì)量較好的DNA模板，并將之稀釋至50ng／μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AFLP反應(yīng)

參照Vos等［16］的方法并稍加改動(dòng)。用限制性內(nèi)切酶EcoRΙ／MseΙ雙酶切，加入接頭連接后先用E－A／M－C預(yù)擴(kuò)引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋后，用篩選出的9對(duì)選擴(kuò)引物（表1）進(jìn)行PCR反應(yīng)。體系為預(yù)擴(kuò)模板1μL，10×Buffer 2μL，MgCl2（25mmol／L）1.2μL，dNTP（2.5mmol／L）1.6μL，EcoRΙ選擴(kuò)引物（10mmol／L）0.4μL，MseΙ選擴(kuò)引物（10mmol／L）0.8μL，Taq酶（5U／μL）0.5U，補(bǔ)足滅菌雙蒸水至20 μL。選擴(kuò)PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃1min（共12個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)退火溫度降低0.7℃，至56℃）；94℃30s，56℃30s，72℃1min（共25個(gè)循環(huán)）；最后72℃延伸10min。選擴(kuò)產(chǎn)物經(jīng)8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染技術(shù)顯帶，GS－800掃描儀記錄凝膠圖譜。

實(shí)驗(yàn)所用的接頭、預(yù)擴(kuò)引物、選擴(kuò)引物均由上海生工生物工程有限公司提供。

1.3 數(shù)據(jù)分析

選取AFLP指紋圖譜中清晰且一致性較強(qiáng)的條帶用于統(tǒng)計(jì)分析。以1和0分別表示條帶的有無(wú)，將AFLP指紋圖譜轉(zhuǎn)化為0和1數(shù)字矩陣。用POPGENE 1.32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及其比例、Nei′s基因多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、遺傳距離和遺傳相似度等。用AMOVA 1.55軟件對(duì)群體間和群體內(nèi)的遺傳變異進(jìn)行分子方差分析。聚類(lèi)分析采用NTSYS 2.1軟件構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

9對(duì)引物組合在2個(gè)大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體的40尾樣品中共擴(kuò)增出381條有效片段（主要分布于100～500 bp），其中多態(tài)片段為288條，多態(tài)位點(diǎn)比例為75.59%（表1）。每對(duì)引物擴(kuò)增位點(diǎn)在36～51個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出42.3個(gè)位點(diǎn)。其中，E－ACG／M－CAT擴(kuò)增片段總數(shù)最多（51條），多態(tài)位點(diǎn)比例也最高（90.20%）；E－AAC／M－CAA擴(kuò)增片段總數(shù)最少（36條），多態(tài)位點(diǎn)比例也最低（63.89%）。圖1為E－ACG／M－CAT引物組合擴(kuò)增的AFLP指紋圖。

表1 2個(gè)大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)比例Table 1 The number and percentage of polymorphic loci in two cultured populations of P.crocea

圖1 E－ACG／M－CAT引物組合擴(kuò)增得到的AFLP指紋圖Fig.1 AFLP band patterns generated by primer combination E－ACG／M－CAT

2.2 2個(gè)大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

9對(duì)引物組合在岱衢洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體和官井洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體中分別擴(kuò)增出363個(gè)和320個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)比例分別為236（65.01%）和184（57.50%）。遺傳多樣性參數(shù)（表2）表明岱衢洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性高于官井洋養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。

表2 2個(gè)大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Parameters of genetic diversity in two cultured populations of P.crocea

2.3 2個(gè)大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體間的遺傳分化

按遺傳多樣性參數(shù)（表2）估算來(lái)自2個(gè)群體間的變異為24.4%，75.6%的遺傳變異來(lái)源于群體內(nèi)不同個(gè)體間。

分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）結(jié)果表明群體間變異占37.74%，62.26%的變異源于群體內(nèi)。顯示出2個(gè)群體的遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)個(gè)體間，但群體間已有一定程度的遺傳分化（表3）。

表3 2個(gè)大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體內(nèi)和群體間的AMOVA分析Table 3 AMOVA within and among two cultured populations of P.crocea

利用NTSYS 2.1軟件以UPGMA法對(duì)大黃魚(yú)2個(gè)群體40個(gè)個(gè)體進(jìn)行聚類(lèi)（圖2）。圖2中D1～D20為岱衢洋養(yǎng)殖群體，M1～M20為官井洋養(yǎng)殖群體，2個(gè)群體各自聚成一支（M1除外）。

圖2 40尾大黃魚(yú)個(gè)體構(gòu)建的UPGMA聚類(lèi)圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 40individuals of P.Crocea

3 討論

我們利用AFLP技術(shù)對(duì)岱衢洋大黃魚(yú)人工繁育F2代與官井洋大黃魚(yú)人工繁育多代的養(yǎng)殖群體遺傳多樣性進(jìn)行了分析和比較。9對(duì)選擴(kuò)引物在40個(gè)大黃魚(yú)樣品中共擴(kuò)增出288個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比例為75.59%，表明AFLP技術(shù)可擴(kuò)增大量多態(tài)性位點(diǎn)，獲得豐富的遺傳信息。經(jīng)檢測(cè)，岱衢洋大黃魚(yú)人工繁育F2代養(yǎng)殖群體的多態(tài)位點(diǎn)比例、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)均高于官井洋大黃魚(yú)人工繁育多代的養(yǎng)殖群體，表明前者的遺傳多樣性高于后者。同已報(bào)道的其他經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)相比，多態(tài)位點(diǎn)百分率高于張全啟等研究的牙鲆（Paralichthysolivaceus）野生群體與養(yǎng)殖群體（40.07%～46.18%）［17］、韓志強(qiáng)等研究的黃姑魚(yú)（Nibeaalbiflora）野生群體（51.70%～51.99%）［18］、鄭德鋒等研究的棘頭梅童魚(yú)（Collichthyslucidus Richardson）野生群體（8.82%～15.07%）［19］及巫旗生等研究的褐毛鲿（Megalonibeafusca）養(yǎng)殖群體（24.60%～25.56%）［20］，低于彭志蘭等研究的舟山鮸魚(yú)（Miichthysmiiuy）群體（68.86%～72.51%）［21］。

岱衢洋大黃魚(yú)人工繁育F2代養(yǎng)殖群體和官井洋大黃魚(yú)人工繁育多代養(yǎng)殖群體間的遺傳分化系數(shù)Gst（0.244 0）和分子方差分析（AMOVA）結(jié)果顯示，2個(gè)群體的遺傳變異主要來(lái)自于群體內(nèi)個(gè)體間，但群體間亦出現(xiàn)了一定程度的遺傳趨異。同時(shí)根據(jù)UPGMA法對(duì)40個(gè)個(gè)體的聚類(lèi)結(jié)果可知，2個(gè)群體明顯分成2支，表現(xiàn)出較顯著的遺傳分化，這和Gst，AMOVA所得結(jié)果相符。2個(gè)群體間存在一定程度的遺傳分化，一方面可能是由于它們的起源親本的來(lái)源不同，分別來(lái)源于岱衢洋及官井洋大黃魚(yú)；另一方面，我們研究的岱衢洋大黃魚(yú)F2代養(yǎng)殖群體是經(jīng)過(guò)科學(xué)選育的群體，仍保持較高的遺傳變異，而官井洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體是未經(jīng)選育的多代繁殖的后代，傳代過(guò)程中伴隨著近交衰退及遺傳漂變等作用，導(dǎo)致其遺傳多樣性降低。

Thorp［22］認(rèn)為不同物種間的遺傳相似系數(shù)I為0.2～0.8（Ds＝0.2～0.8），同科屬群體間I為0.1～0.5（Ds＝0.5～0.9），同種群體間I為0.8～0.97（Ds＝0.03～0.2）。本研究的2個(gè)養(yǎng)殖群體間的遺傳相似度為0.895 3，遺傳距離為0.110 6，表明岱衢洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體和官井洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體仍屬于同種群體間的范圍內(nèi)，沒(méi)有造成大的分化。岱衢洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體和官井洋大黃魚(yú)養(yǎng)殖群體間Nm值為1.549 5，表明大黃魚(yú)2群體間存在一定程度的遺傳信息交流。

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